• facebook
  • linkedin
  • youtube

Am fréie Stadium vum Ausbroch, wéinst der rapider Entwécklung, ass eng séier Diagnostik vu verdächtege Patienten de Schlëssel fir COVID-19 ze vermeiden.E puer guttgeheescht Nukleinsäure Detektiounsreagens hunn eng kuerz Entwécklungszäit, an et gi Probleemer wéi séier Leeschtungsbestätegung, net genuch Reagensoptimiséierung a grouss Differenzen tëscht Chargen;D'Problemer vu verschiddene klineschen Laboratoiren a verschiddenen Aspekter vum Nukleinsäureerkennungsprozess kënnen och d'Genauegkeet vun den Nukleinsäureerkennungsresultater beaflossen.Dësen Artikel konzentréiert sech op d'Schlëssellinks a Punkten an der aktueller SARS-CoV-2 Nukleinsäureerkennung, an analyséiert d'Problemer vu falschen negativen a positiven Neiuntersuchung vun der Laboratoire Nukleinsäure Detektioun a klinescher Inkonsistenz.

Prinzipien vun der SARS-CoV-2 Nukleinsäure Detektioun

SARS-CoV-2 ass en RNA Virus mat enger Genom Sequenz vun ongeféier 29 kb, mat 10 Genen, déi effektiv 10 Proteine ​​​​codéiere kënnen.Virussen besteet aus RNA a Protein, an déi äusserst Schicht ass eng baussenzeg Beschichtung aus Lipiden a Glykoproteine.Bannen wéckelt de Proteinkapsid d'RNA dran, a schützt domat déi liicht ofbaubar RNA (P1).

zfgd

P1 Struktur vun SARS-COV-2

Viren invadéieren Zellen duerch spezifesch Zelloberfläche Rezeptoren fir Infektioun ze verursaachen, a benotzen Hostzellen fir ze replizéieren.

De Prinzip vun der viraler Nukleinsäure Detektioun ass d'viral RNA duerch en Zelllysat auszesetzen, an dann Echtzäit fluoreszent ëmgedréint Transkriptiouns-Polymerase Kettenreaktioun (RT-PCR) fir Detektioun ze benotzen.

De Schlëssel zum Detektiounsprinzip ass Primer a Sonden ze benotzen fir "geziilt Matching" vun Nukleinsäuresequenzen z'erreechen, dat heescht d'Nukleinsäure Sequenz vu SARS-CoV-2 ze fannen déi anescht ass wéi aner Virussen an ongeféier 30.000 Basen (d'Ähnlechkeet vun Nukleinsäure zu anere Virussen) "Niddereg" Beräich), Design Primer a Sonden.

D'Primeren an d'Sonden sinn héich ugepasst mat der spezifescher Regioun vun der SARS-CoV-2 Nukleinsäure, dat heescht, d'Spezifizitéit ass ganz staark.Wann d'Echtzäit fluoreszent RT-PCR Amplifikatiounsresultat vun der Probe fir ze testen positiv ass, beweist et datt SARS-CoV-2 an der Probe präsent ass.Kuckt P2.

zfgd2

P2 Schrëtt vun der SARS-CoV-2 Nukleinsäurebestëmmung (Echtzäit fluoreszent RT-PCR)

Konditiounen an Ufuerderunge vum Laboratoire fir SARS-CoV-2 Nukleinsäure Detektioun

Nukleinsäure Testlaboratoiren sinn déi ideal fir negativ Drockëmfeld, a si sollten op Drockmonitoréierung oppassen, d'Loft fléissen an Aerosolen eliminéieren.Nukleinsäure Testpersonal muss entspriechend Qualifikatiounen hunn, relevant Polymerase Kette Reaktioun Training kréien an d'Bewäertung passéieren.De Laboratoire soll strikt geréiert ginn, zonéiert op der Plaz, an irrelevant Personal ass streng verbueden ze kommen.Déi propper Plaz soll gelëfter an desinizeiert ginn op der Plaz.Relevant Saache ginn an Zonen plazéiert, propper a dreckeg ginn getrennt, op Zäit ersat an op der Plaz dekontaminéiert.Routine Desinfektioun: Chlor-enthaltende Desinfektiounsmëttel ass d'Haaptléisung fir méi grouss Flächen, a 75% Alkohol ka fir kleng Flächen benotzt ginn.E gudde Wee fir mat Aerosolen ëmzegoen ass d'Fënstere fir Belëftung opzemaachen, an d'Loftdesinfektioun kann och duerch ultraviolet Strahlen, Filtratioun a Loftdesinfektioun duerchgefouert ginn.

Schlëssellink a Parameter vun der SARS-CoV-2 Nukleinsäurebestëmmung (Echtzäit fluoreszent RT-PCR)

Och wann d'Laboratoiren allgemeng op Nukleinsäure "Erkennung" opmierksam maachen, ass d'Nukleinsäure "Extraktioun" och ee vun de Schlëssel Schrëtt fir eng erfollegräich Detektioun, déi enk mat der Sammlung a Lagerung vu Virusproben verbonnen ass.

Am Moment benotzen déi meescht verbreet Atmungsproben, sou wéi Nasopharyngeal Swabs, déi zweet Method, dat ass eng Inaktivéierung (Konservatioun) Léisung virbereet op Basis vun der Nukleinsäure Extraktioun a Lysis Léisung.Engersäits kann dës Viruskonservéierungsléisung de Protein vum Virus denaturéieren, seng Aktivitéit verléieren an net méi ustiechend sinn, an d'Sécherheet vun der Transport- an Detektiounsstadium verbesseren;op der anerer Säit kann et de Virus direkt knacken fir d'Nukleinsäure ze verëffentlechen, den Nukleinsäure zerfallend Enzym ze eliminéieren an de Virus ze vermeiden.D'RNA gëtt ofgebaut.

Eng Virusprobeléisung virbereet op Basis vun der Nukleinsäure Extraktioun Lysis Léisung.D'Haaptkomponente si equilibréiert Salzer, Ethylendiamintetraediksäure chelatéierend Agent, Guanidin Salz (Guanidin Isothiocyanat, Guanidin Hydrochlorid, etc.), Anionesch Surfaktant (Dodecan) Natriumsulfat), kationesch Surfaktant (Tetradecyltrimethylammoniumoxalat), Phenotheninol, 8-Hydroxylin, 8-Hydroxylin, e puer Komponenten, Phenothenol, K.Am Moment ginn et vill Aarte vun Nukleinsäure Extraktiounskits, a verschidde Nukleinsäure Extraktiouns- a Reinigungsreagenz gi benotzt.Och wann déiselwecht Nukleinsäure Extraktioun a Reinigungsreagens benotzt gëtt, sinn d'Extraktiounsprozeduren vun all Kit anescht.

Am Moment sinn d'Nukleinsäure Detektioun Kit Produkter, déi vun der National Medical Products Administration guttgeheescht goufen, ausgewielt op Basis vun den ORF1ab, E an N Genen am SARS-CoV-2 Genom.D'Detektiounsprinzipien vu verschiddene Produkter sinn am Fong d'selwecht, awer hir Primer a Sondedesign sinn ënnerschiddlech.Et gi Single-Zil Segmenter (ORF1ab), Dual-Zil Segmenter (ORF1ab, N oder E), an dräi-Ziel Segmenter (ORF1ab, N an E).Den Ënnerscheed tëscht Detektioun an Interpretatioun, Nukleinsäure Extraktioun an Echtzäit fluoreszent RT-PCR Reaktiounssystem sollt op déi entspriechend Kitinstruktioune bezéien, an et ass recommandéiert datt d'Benotzer strikt d'Interpretatiounsmethod befollegen, déi an de Kitinstruktioune fir Interpretatioun spezifizéiert sinn.Déi gemeinsam Regiounen, Primer a Sondesequenzen, déi duerch Echtzäit fluoreszent RT-PCR verstäerkt ginn, ginn am P3 gewisen.

zfgd3

P3 D'Plaz vum SARS-CoV-2 Amplicon Zil um Genom an d'Sequenz vu Primer a Sonden

Interpretatioun vun de Resultater vun der SARS-CoV-2 Nukleinsäurebestëmmung (Reel-Time fluorescent RT-PCR)

"Pneumonie Präventioun a Kontrollplang fir SARS-CoV-2 Infektioun (zweet Editioun)" fir d'éischte Kéier klären d'Critèrë fir d'Resultater vun enger eenzeger Gen Amplifikatioun ze beurteelen:

1. Kee Ct oder Ct≥40 ass negativ;

2. Ct<37 ass positiv;

3. De Ct-Wäert vun 37-40 ass d'Grau-Skalaberäich.Et ass recommandéiert d'Experiment ze widderhuelen.Wann d'Resultat vum neien Ct <40 an d'Verstäerkungskurve offensichtlech Peaks huet, gëtt d'Probe als positiv beurteelt, soss ass et negativ.

Déi drëtt Editioun vum Guide an déi véiert Editioun vum Guide hunn déi uewe genannte Critèren weidergefouert.Wéi och ëmmer, wéinst de verschiddenen Ziler, déi a kommerziellen Kits benotzt ginn, huet déi genannte 3. Editioun vum Guide net d'Critèrë ginn fir d'Kombinatioun vun Ziler ze bestëmmen, ënnersträicht d'Instruktioune vum Hiersteller virrangen.Vun der fënnefter Editioun vun de Richtlinnen un, goufen zwee Ziler gekläert, besonnesch d'Uerteel Critèrë fir een eenzegt Zil dat schwéier ze beurteelen ass.Dat ass, wann de Laboratoire wëll bestätegen datt e Fall positiv ass fir d'SARS-CoV-2 Nukleinsäure Detektioun, muss déi folgend 1 vun 2 Bedéngungen erfëllt ginn:

(1) Zwee Ziler vu SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) an der selwechter Probe gi positiv getest duerch Echtzäit fluoreszent RT-PCR.Wann een eenzegt Zil positiv ass, sinn nei Proben an nei Tester erfuerderlech.Wann d'Testresultater sinn Wann dat eenzegt Zil nach ëmmer positiv ass, gëtt et als positiv beurteelt.

(2) Zwee Echantillon vun Echtzäit fluorescerende RT-PCR weisen eng eenzeg Zil-positiv zur selwechter Zäit oder zwee Echantillon vun der selwechter Zort huet eng eenzeg Zil-positiv Test Resultat gewisen, déi als positiv beurteelt ginn.Wéi och ëmmer, d'Richtlinnen ënnersträichen och datt déi negativ Resultater vun Nukleinsäure Tester d'SARS-CoV-2 Infektioun net kënnen ausschléissen.Faktoren, déi falsch Negativer verursaache kënnen, mussen ausgeschloss ginn, dorënner schlecht Probequalitéit (Atmungsproben aus Oropharynx an aner Deeler), Probesammlung ze fréi oder ze spéit, Echantillon goufen net gespäichert, transportéiert a korrekt veraarbecht, an d'Technologie selwer hat Problemer (Virusvariatioun, PCR Hemmung), etc.

Ursaache vu falschen Negativer an der SARS-CoV-2 Detektioun

D'Konzept vu "falsch negativ" am Nukleinsäure Testen, dat momentan betraff ass, bezitt sech dacks op "falsch Negativer" an deenen d'Nukleinsäure Testresultater inkonsistent mat klineschen Manifestatiounen sinn, dat heescht, klinesch Symptomer a Bildgebitt Resultater sinn héich verdächtegt vum COVID-19, awer Nukleinsäure Tester sinn ëmmer "negativ" vill Mol.De Clinical Laboratory Center vun der National Health Commission erkläert de "falsch negativ" SARS-CoV-2 Test.

(1) Et gëtt eng gewësse Quantitéit vu Virus an den Zellen vun der infizéierter Persoun.Existéiert Donnéeën weisen datt nodeems de Kierper vum Virus infizéiert ass, de Virus an den Hals duerch d'Nues an de Mond erakënnt, dann an d'Trachea an d'Bronchien, an dann an d'Alveoli.Déi infizéiert Persoun wäert d'Inkubatiounsperiod erliewen, mild Symptomer, an dann de Prozess vu schwéiere Symptomer, a verschidde Stadien vun der Krankheet.An d'Quantitéit vum Virus präsent a verschiddenen Deeler vum Kierper ass anescht.

Am Sënn vun der viraler Belaaschtung vun Zelltypen, Alveolar Epithelzellen (ënneschten Atmungstrakt)> Airway Epithelzellen (iewescht Atmungstrakt)> Fibroblasten, Endothelzellen a Makrophagen, asw.vun der Probetyp, Alveolar Lavage Flëssegkeet (déi Excellent)>déif Hust Sputum>Nasopharyngeal Swab>oropharyngeal Swab>Blutt.Ausserdeem kann de Virus och an de Kot festgestallt ginn.Wéi och ëmmer, wann Dir d'Bequemlechkeet vun der Operatioun an d'Akzeptanz vu Patienten berücksichtegt, ass déi allgemeng benotzt klinesch Probebestellung Oropharyngeal Swab> Nasopharyngeal Swab> Bronchial Lavage Flëssegkeet (komplex Operatioun) an déif Sputum (normalerweis dréchen Hust, schwéier ze kréien).

Dofir ass d'Quantitéit vum Virus an den Zellen vum Oropharynx oder Nasopharynx vun e puer Patienten kleng oder extrem niddereg.Wann nëmmen Proben vum Oropharynx oder Nasopharynx fir Tester geholl ginn, gëtt d'viral Nukleinsäure net festgestallt.

(2) Keng Virus-enthale Zellen goufen während Prouf Sammlung gesammelt, oder viral Nukleinsäure war net effektiv preservéiert.

[① Ongerechte Sammelplaz, zum Beispill, beim Sammelen vun Oropharyngeal Swabs, ass d'Sammlungsdéift net genuch, déi gesammelt Nasopharyngeal Swabs ginn net déif an der Nasehöhle gesammelt, asw.

②Sampling Swabs ginn falsch benotzt.Zum Beispill, syntheteschen Faseren wéi PE-Faser, Polyesterfaser a Polypropylenfaser si fir d'Material vum Swabkopf recommandéiert.Natierlech Faseren wéi Koteng ginn an der aktueller Operatioun benotzt (staark Adsorptioun vu Protein an net einfach ze wäschen) An Nylonfasern (schlecht Waasserabsorption, wat zu net genuch Probevolumen féiert);

③ Falsch Notzung vu Virusspäicherröhren, sou wéi Mëssbrauch vu Polypropylen oder Polyethylen Plastikspäicherröhren, déi einfach Nukleinsäuren (DNA / RNA) absorbéieren, wat zu enger Ofsenkung vun der Konzentratioun vun der Nukleinsäure an der Späicherléisung resultéiert.An der Praxis ass et recommandéiert Polyethylen-Propylen Polymer Plastik an e puer speziell behandelt Polypropylen Plastikbehälter ze benotzen fir viral Nukleinsäuren ze späicheren.]

[① Ongerechte Sammelplaz, zum Beispill, beim Sammelen vun Oropharyngeal Swabs, ass d'Sammlungsdéift net genuch, déi gesammelt Nasopharyngeal Swabs ginn net déif an der Nasehöhle gesammelt, asw.

②Sampling Swabs ginn falsch benotzt.Zum Beispill, syntheteschen Faseren wéi PE-Faser, Polyesterfaser a Polypropylenfaser si fir d'Material vum Swabkopf recommandéiert.Natierlech Faseren wéi Koteng ginn an der aktueller Operatioun benotzt (staark Adsorptioun vu Protein an net einfach ze wäschen) An Nylonfasern (schlecht Waasserabsorption, wat zu net genuch Probevolumen féiert);

③ Falsch Notzung vu Virusspäicherröhren, sou wéi Mëssbrauch vu Polypropylen oder Polyethylen Plastikspäicherröhren, déi einfach Nukleinsäuren (DNA / RNA) absorbéieren, wat zu enger Ofsenkung vun der Konzentratioun vun der Nukleinsäure an der Späicherléisung resultéiert.An der Praxis ass et recommandéiert Polyethylen-Propylen Polymer Plastik an e puer speziell behandelt Polypropylen Plastikbehälter ze benotzen fir viral Nukleinsäuren ze späicheren.]

(4) D'klinesch Labo Operatioun ass net standardiséiert.Sample Transport a Lagerbedéngungen, standardiséierte Operatioun vu klineschen Laboratoiren, Resultatinterpretatioun a Qualitéitskontroll sinn d'Schlësselfaktoren fir d'Genauegkeet an Zouverlässegkeet vun den Testresultater ze garantéieren.Geméiss d'Resultater vun der externer Qualitéitsevaluatioun, déi vum Clinical Laboratory Center vun der National Health Commission de 16.-24. Mäerz 2020 duerchgefouert gouf, vun den 844 Laboratoiren, déi gëlteg Resultater kruten, waren 701 (83.1%) qualifizéiert, an 143 (16.9%) net.Qualifizéiert sinn d'allgemeng Laboratoire Testbedéngungen gutt, awer verschidde Laboratoiren hunn nach ëmmer Differenzen an der Personaloperatiounsfäegkeet, Single-Zil-positiv Probeinterpretatiounsfäegkeet, a Qualitéitskontroll.

Wéi reduzéieren ech de falschen Negativ vun der SARS-CoV-2 Nukleinsäure Detektioun?

D'Reduktioun vu falschen Negativer bei der Nukleinsäureerkennung soll aus de véier Aspekter vun der Produktioun vu falschen Negativer optimiséiert ginn.

(1) Et gëtt eng gewësse Quantitéit vu Virus an den Zellen vun der infizéierter Persoun.D'Konzentratioun vum Virus a verschiddenen Deeler vum Kierper vu verdächtege infizéierte Persounen wäert zu verschiddenen Zäiten ënnerschiddlech sinn.Wann et kee Pharynx ass, kann et a bronchial Lavage Flëssegkeet oder Feeën sinn.Wann méi Aarte vu Proben zur selwechter Zäit oder a verschiddene Stadien vun der Krankheetprogressioun gesammelt kënne ginn fir Testen, hëlleft falsch Negativer ze vermeiden.

(2) Zellen, déi Virus enthalen, solle wärend der Probesammlung gesammelt ginn.Dëse Problem kann zu engem groussen Deel geléist ginn duerch d'Stäerkung vun der Ausbildung vun Prouf Sammler.

(3) Zouverlässeg IVD Reagenz.Andeems Dir Fuerschung iwwer d'Detectiounsleeschtungsbewäertung vu Reagenser op nationalem Niveau ausféiert, an iwwer déi existent Probleemer diskutéiert, kann d'Detektiounseffizienz vun de Reagenzë weider verbessert ginn an d'Sensibilitéit vun der Analyse verbessert ginn.

(4) Standardiséierter Operatioun vu klineschen Laboratoiren.Duerch d'Stäerkung vun der Ausbildung vum Laboratoire Personal, kontinuéierlech de Laboratoire Qualitéitsmanagement System ze verbesseren, raisonnabel Divisiounen ze garantéieren an d'Fäegkeet vum Personal z'entdecken ze verbesseren, ass et méiglech falsch Negativer ze reduzéieren wéinst falschen Labo Operatiounen.

Grënn fir den neien Test positiv vum SARS-CoV-2 Nukleinsäure Test bei erholl an entlooss Patienten

De "COVID-19 Diagnos a Behandlungsplang (Trial Seventh Edition)" stellt kloer fest datt ee vun de Critèrë fir COVID-19 Patienten geheelt an aus dem Spidol entlooss ze ginn ass datt zwee konsekutiv Atmungstraktproben en negativen Nukleinsäuretest hunn (op d'mannst 24 Stonnen ausser), awer et gi ganz wéineg D'SARS-CoV-2 erëm positiv Nukleinsäure Tester waren a verschiddene Nukleinsäure Tester positiv.

(1) SARS-CoV-2 ass en neie Virus.Et ass néideg fir säi pathogene Mechanismus weider ze verstoen, dat ganzt Bild vun der verursaachter Krankheet an d'Charakteristiken vum Krankheetsverlaf.Dofir, op der enger Säit, ass et néideg d'Gestioun vun entlooss Patienten ze stäerken an 14-Deeg medezinesch Observatioun ze maachen.Maacht Suivi, Gesondheetsiwwerwaachung a Gesondheetsleit fir d'Verständnis vum ganze Prozess vum Optriede, Entwécklung an Resultat vun der Krankheet ze verdéiwen.

(2) De Patient kann erëm mam Virus infizéiert sinn.Den Akademiker Zhong Nanshan sot: Well geheelt Patienten Antikörper hunn, kann SARS-CoV-2 duerch Antikörper eliminéiert ginn wa se erëm invadéieren.Et gi vill Grënn, déi d'Ursaach vum erhollene Patient kënne sinn, oder et kann mat der Mutatioun vum Virus verbonne sinn, oder souguer d'Ursaach vum Labo Tester.Wann et de Virus selwer ass, kann d'SARS-CoV-2 Mutatioun verursaachen datt den Antikörper produzéiert vum erhollene Patient ineffektiv géint de mutéierte Virus ass.Wann de Patient erëm mam mutéierte Virus infizéiert ass, kann den Nukleinsäuretest erëm positiv sinn.

(3) Wat d'Laboratoire Testmethoden ugeet, huet all Testmethod seng Aschränkungen.SARS-CoV-2 Nukleinsäure Detektioun ass wéinst der Wiel vun der Gensequenz, der Zesummesetzung vun de Reagenser, der Empfindlechkeet vun der Method an aner Grënn, déi zu existéierende Kits féieren hir eege méi niddereg Detektiounsgrenzen.Nodeems de Patient behandelt gëtt, fällt de Virus am Kierper erof.Wann d'viral Belaaschtung an der Probe fir ze testen ënner der ënneschter Detektiounsgrenz ass, erschéngt en "negativ" Resultat.Wéi och ëmmer, dëst Resultat heescht net datt de Virus am Kierper komplett verschwonnen ass.De Virus kann no der Behandlung gestoppt ginn.Resurgence", weider kopéieren.Dofir ass et recommandéiert eemol d'Woch bannent 2 bis 4 Wochen no der Entladung ze iwwerpréiwen.

(4) Nukleinsäure ass dat genetesch Material vum Virus.De Virus gëtt ëmbruecht nodeems de Patient antiviral Behandlung erlieft huet, awer déi verbleiwen viral RNA Fragmenter ginn nach ëmmer am mënschleche Kierper behalen, a ginn net komplett aus dem Kierper entlooss.Heiansdo, ënner bestëmmten Ëmstänn, kann et méi erhale bleiwen.Eng laang Zäit, an zu dëser Zäit wäert den Nukleinsäuretest "transient" positiv sinn.Mat der Verlängerung vun der Erhuelungszäit vum Patient, nodeems d'Rescht-RNA-Fragmenter am Kierper graduell erschöpft sinn, kann d'Nukleinsäure-Testresultat negativ ginn.

(5) D'Nukleinsäure Testresultat vu SARS-CoV-2 beweist nëmmen d'Präsenz oder d'Feele vu viraler RNA, a kann d'Aktivitéit vum Virus net beweisen an ob de Virus iwwerdrobar ass.Et ass néideg ze beweisen ob e Patient deen erëm e positiven Nukleinsäuretest huet erëm eng Infektiounsquell gëtt.Et ass néideg Viruskultur op klineschen Echantillon auszeféieren an e "Live" Virus ze kultivéieren fir ze beweisen datt et infektiiv ass.

Resumé

Zesummegefaasst, SARS-CoV-2 Nukleinsäure Test falsch Negativer, Retest Positiver, an aner Bedéngungen, déi net konsequent mat klineschen Manifestatiounen sinn, kënnen net komplett vermeit ginn.Am aktuellen Screening an Tester ass et recommandéiert klinesch Symptomer, Imaging Examen (CT) an Experimenter ze kombinéieren Laboratoire Test (Nukleinsäure Test + Virusspezifesch Antikörper Test) Resultater fir eng ëmfaassend Diagnostik fir vermësst Diagnos a falsch Diagnostik ze vermeiden.Wann d'Testresultater selbstverständlech net konsequent mat de klineschen Manifestatiounen fonnt ginn, ass et recommandéiert eng ëmfaassend Analyse vum ganzen Testlink ze maachen (Proufsammlung, Zirkulatioun a Veraarbechtungslinks) fir SARS-CoV-2 Virus fréi Infektioun auszeschléissen, widderhuelend Infektioun oder kombinéiert mat anere Atmungsvirus Infektiounen, etc.Wann d'Konditioune et erlaben, ass et recommandéiert méi sensibel Proben ze sammelen wéi Sputum oder Alveolar Lavage Flëssegkeet fir nei Untersuchung.

Zesummenhang Produkter:

SARS-CoV-2 Nukleinsäure Detektioun Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)


Post Zäit: Sep-03-2021