D'Performance vun de Primer a Sonden am fréie Stadium vu PCR-Reagenz z'iwwerpréiwen an déi gëeegent Reaktiounsbedéngungen ze bestëmmen sinn d'Viraussetzunge fir de glate Fortschrëtt vu formellen Experimenter ze garantéieren.
Also wéi musse mir d'Primersonde an der fréicher Etapp bestätegen?
D'Haaptindikatoren sinn d'Basislinn, d'Verstäerkungskurve, d'Ct-Wäert, d'Verstäerkungseffizienz, d'niddereg Konzentratioun Probe Detektioun, CV, asw.
Baseline
D'Basislinn ass déi horizontal Linn an der PCR Amplifikatiounskurve.An den éischte puer Zyklen vun der PCR Amplifikatiounsreaktioun ännert d'Fluoreszenzsignal net vill a bildt eng riicht Linn.Dës riicht Linn ass d'Basislinn.
Wann Dir PCR Primer Sonden screent, oppassen ob d'Basislinn Niveau ass.D'Rengheet vun der Primer Sonde Konzentratioun wäert d'Basislinn beaflossen, sou wéi d'Basislinn erop oder erof geet.D'Basislinn ass och e ganz intuitive Indikator.
Amplification Curve
En aneren intuitive Indikator ass d'Form vun der Amplifikatiounskurve.Et ass am beschten eng S-förmlech Curve ze hunn fir sekundär Verstäerkung oder aner anormal Verstäerkungskurven ze vermeiden.
Ct Wäert
D'Zuel vun den Zyklen entsprécht dem Inflektiounspunkt vun der Basislinn bis zum exponentielle Wuesstum ass de Ct-Wäert.
Fir déiselwecht Probe resultéieren verschidde Primersonden a verschiddene Amplifikatiounskurven, an de entspriechende Ct-Wäert gëtt vun der Amplifikatiounseffizienz an der Amplifikatiounsgrad beaflosst.An der Theorie, wat méi kleng de Ct Wäert vun der Primer Sonde mir wielen, desto besser.
Amplifikatioun Effizienz
Ee vun de stäerkste zouverlässeg a stabil Methode fir Evaluatioun vun PCR Amplifikatioun Effizienz ass d'Standard Curve, déi och wäit vun Fuerscher unerkannt ass.D'Method ëmfaasst eng Serie vu Proben ze maachen fir d'relativ Unzuel vun Zil-Templates ze kontrolléieren.Dës Proben ginn normalerweis duerch seriell Verdünnungen vu konzentréierte Stammléisungen gemaach, déi meescht benotzt ass 10-fach Verdünnung.Benotzt eng Serie vu verdënntem Echantillon, benotzt Standard qPCR Programm fir ze verstäerken fir de Cq Wäert ze kréien, a schliisslech eng Standardkurve no der Konzentratioun vun all Probe an dem entspriechende Cq Wäert ze zéien fir d'linear Equatioun Cq = -klgX0 + b ze kréien, an d'Verstäerkungseffizienz E = 10 (-1 /k) -1.Wann Dir qPCR fir quantitativ Analyse benotzt, ass d'Verstäerkungseffizienz erfuerderlech am Beräich vun 90% -110% (3.6>k>3.1) ze sinn.
Niddereg Konzentratioun Proben Detektioun
Wann d'Probe Konzentratioun niddereg ass, sinn d'Detektiounsraten vu verschiddene Primer Sonden anescht.Mir wielt 20 niddereg-Konzentratioun Echantillon ze replizéieren, an de Primer-Sonde System mat der héchster Detectioun Taux ass déi bescht.
Variatiounskoeffizient (CV)
10 duplizéiert Echantillon kënne mat verschiddene primer Sonden no der Linn Norm vun der reagent fir Nukleinsäure amplification Detectioun entdeckt ginn.
Quantitativ Reagens:
Genauegkeet
D'Genauegkeet an enger Partie soll erfëllen: de Variatiounskoeffizient (CV,%) vum logarithmesche Wäert vun der Testkonzentratioun ass ≤5%.Wann d'Probe Konzentratioun niddereg ass, ass de Variatiounskoeffizient (CV,%) vum Logarithmus vun der Detektiounskonzentratioun ≤10%
Qualitativ Reagens:
Genauegkeet
D'Genauegkeet an enger Batch soll entspriechen:
(1) Variatiounskoeffizient vum Ct Wäert (CV,%) ≤5%
Déiselwecht Probe gëtt 10 Mol parallel getest, an d'Testresultater solle konsequent sinn
Post Zäit: Sep-18-2021
