Ech gleewen datt jidderee ëmmer sou oder sou Probleemer begéint wann Dir PCR Reaktiounen mécht, awer déi meescht vun hinnen kënnen an zwee Haaptprobleemer klasséiert ginn:

Ze wéineg Amplifikatioun vun der Gen-Schabloun (Amplifikatioun);
Ze vill Net-Zil-Gen Amplifikatioun.
Additive benotzen ass eng vun de gemeinsame Strategien fir dës Probleemer ze léisen.Normalerweis huet d'Roll vun Additiven zwee Aspekter:
sekundär Strukturvun Genen (sekundär Struktur);
Reduzéieren net spezifesch priming.
Haut wäert den Editeur Iech kuerz déi gemeinsam Zousatzstoffer an PCR Reaktiounen an hir Funktiounen virstellen.
Additiven déi sekundär Struktur reduzéieren
sulfoxid(DMSO)
Genprobenmat héijen GC Inhalt.Wéi och ëmmer, DMSO reduzéiert och Taq Polymerase Aktivitéit staark.Dofir muss jiddereen d'Schabloun Accessibilitéit an d'Aktivitéit vun der Polymerase balanséieren.Den Editeur proposéiert datt Dir verschidde Konzentratioune vun DSMO probéieren kënnt, wéi vun 2% bis 10%, fir d'Konzentratioun ze fannen déi Ären Experiment passt.
Non-ionesch Detergenten
Net-ionesch Detergenten, wéi 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 oder NP-40, reduzéieren normalerweis DNA sekundär Struktur.Och wann dëst d'Verstäerkung vum Schabloungen erhéijen kann, wäert et och de Problem vun der net spezifescher Amplifikatioun verursaachen.Also, dës Zousatzstoffer funktionnéieren gutt fir PCR Reaktiounen mat nidderegen Ausbezuelen ouni Schutt, awer net sou gutt fir relativ onrein PRC Reaktiounen.En anere Virdeel vun net-ionesche Detergenten ass d'Reduktioun vun der SDS Kontaminatioun.Normalerweis wärend dem DNA Extraktiounsprozess gëtt SDS an de PCR Schrëtt bruecht, wat d'Aktivitéit vun der Polymerase staark hemmt.Dofir, 0,5% Tween-20 oder Tween-40 op d'Reaktioun ze addéieren kann déi negativ Auswierkunge vum SDS neutraliséieren.
Betaine_
Betaine kann d'DNA Amplifikatioun verbesseren andeems se sekundär Strukturbildung reduzéieren an ass allgemeng e "Geheimnis" Zousatz zu kommerziellen PCR Kits.Wann Dir Betain benotze wëllt, sollt Dir Betain oder Betain Monohydrat (Betain oder Betain Monohydrat) setzen, awer net Betain Hydrochlorid (Betain HCl), ajustéieren op eng final Konzentratioun vun 1-1.7M.Betaine kann och hëllefen d'Spezifizitéit ze verbesseren well et d'Basepaarkompositiounsofhängegkeet vun der DNA Schmelz / DNA Denaturatioun eliminéiert.
Additive fir net spezifesch Primen ze reduzéieren
Formamid
Formamid ass en allgemeng benotzt organeschen PCR-Additiv.Et kann mat grousser Groove a kleng Groove an DNA kombinéieren, doduerch d'Stabilitéit vun der Master DNA Duebelhelix reduzéieren an d'Schmelztemperatur vun der DNA erofsetzen.D'Konzentratioun vu Formamid benotzt an PCR Experimenter ass normalerweis 1% -5%.
TetramethylAmmoniumchlorid( TMAC)
Tetramethylammoniumchlorid kann d'Spezifizitéit vun der Hybridiséierung erhéijen (Hybridiséierungsspezifizitéit) an d'Schmelztemperatur vun der DNA erhéijen.Also, TMAC kann net-spezifesch Primen ewechhuelen an d'Mëssverbindung vun DNA a RNA reduzéieren.Wann Dir benotztdegeneréiert Primeran der PCR Reaktioun, erënnert un TMAC ze addéieren, wat allgemeng bei enger Konzentratioun vu 15-100mM benotzt gëtt.
Aner gemeinsam Zousätz
Zousätzlech zu den zwou Kategorien vun Additive uewen ernimmt, ginn et vill gemeinsam Zousätz an PCR Reaktiounen, obwuel si verschidde Funktiounen hunn, si sinn och ganz wichteg.
Magnesium Ion
Magnesiumion ass en onverzichtbare Kofaktor (Kofaktor) vu Polymerase, dat heescht ouni Magnesiumion ass Polymerase inaktiv.Wéi och ëmmer, ze vill Magnesiumionen kënnen och d'Effizienz vun der Polymerase beaflossen.D'Konzentratioun vu Magnesiumionen an all PCR Reaktioun wäert variéieren.Chelating Agenten (wéi EDTA oder Citrat), d'Konzentratioun vun dNTPs a Proteinen all Afloss op d'Konzentratioun vu Magnesium Ionen.Also, wann Dir Probleemer mat Ärem PCR Experiment hutt, kënnt Dir probéieren verschidde Magnesiumionkonzentratioune z'änneren, zum Beispill vun 1.0 op 4.0mM, mat engem Intervall vun 0.5-1mM tëscht.
Et ass derwäert ze bemierken datt verschidde Afréiere-Thaw-Zyklen zu enger Konzentratiounsstratifikatioun vun der Magnesiumchloridléisung féieren.Dofir musst Dir et virum Gebrauch komplett opléisen a gutt vermëschen ier Dir se benotzt.
Bovine Serum Albumin(Bovine Albumin, BSA)
A molekulare Chimie Experimenter ass Bovine Serum Albumin e ganz heefeg Additiv, besonnesch a Restriktiounsenzym Verdauung a PCR Experimenter.Bei PCR Reaktiounen ass BSA hëllefräich fir Kontaminanten wéi phenolesch Verbindungen ze reduzéieren.An et gëtt och gesot datt et d'Adhäsioun vu Reaktanten op d'Mauer vum Reagenzglieser reduzéiere kann.An der PCR Reaktioun kann normalerweis d'Konzentratioun vu BSA bäigefüügt 0,8 mg / ml erreechen.
 
Zesummenhang Produkter:
PCR Held(mat Faarf)
PCR Held