Fluoreszenz quantitativ PCR (och bekannt als TaqMan PCR, heineider FQ-PCR bezeechent) ass eng nei Nukleinsäure quantitativ Technologie, déi vum PE (Perkin Elmer) an den USA am Joer 1995 entwéckelt gouf.Am Verglach mat flexiblen PCR huet FQ-PCR vill Virdeeler fir seng quantitativ Funktioun ze realiséieren.Dësen Artikel wëlles kuerz d'Charakteristiken, Prinzipien, Methoden an Uwendungen vun der Technologie ze beschreiwen.
1 Fonctiounen
FQ-PCR huet net nëmmen déi héich Empfindlechkeet vum gewéinleche PCR, awer och wéinst der Uwendung vu Leuchtstoffsonden, kann et direkt d'Verännerung vum Fluoreszenz-Signal während der PCR-Verstäerkung duerch de photoelektresche Leedungssystem erkennen fir quantitativ Resultater ze kréien, déi vill Mängel vu konventionelle PCR iwwerwannen, sou datt et och déi héich Spezifizitéit vun der DNA-Genauegkeet an der héijer Spezifizitéit vun der DNA-Hybridiséierung huet.
Zum Beispill mussen allgemeng PCR Produkter duerch Agarosegel Elektrophorese an Ethidiumbromid-Faarwen mat ultraviolettem Liicht oder duerch Polyacrylamid-Gelelektrophorese a Sëlwerfärung observéiert ginn.Dëst erfuerdert net nëmmen e puer Instrumenter, mee brauch och Zäit an Effort.D'Flecken benotzt Ethidiumbromid ass schiedlech fir de mënschleche Kierper, an dës komplizéiert experimentell Prozedure bidden Méiglechkeete fir Verschmotzung a falsch Positiver.Wéi och ëmmer, FQ-PCR brauch nëmmen den Deckel eemol wärend der Probebelaaschtung opzemaachen, an de spéidere Prozess ass komplett zougemaach Tube Operatioun, déi keng PCR Postveraarbechtung erfuerdert, vill Nodeeler bei konventionelle PCR Operatiounen vermeiden.Den Experiment benotzt allgemeng den ABI7100 PCR thermesche Cycler entwéckelt vun der PE Firma.
D'Instrument huet déi folgend Charakteristiken: ① Breet Applikatioun: Et kann benotzt ginn fir DNA an RNA PCR Produktquantifikatioun, Genausdrockfuerschung, Pathogenerkennung an Optimiséierung vu PCR Bedéngungen.② Eenzegaarteg quantitativ Prinzip: Mat fluoreszent markéierte Sonden akkumuléiert d'Quantitéit vun der Fluoreszenz mam PCR Zyklus no Laser Excitatioun, fir den Zweck vun der Quantifizéierung z'erreechen.③ Héich Aarbechtseffizienz: Built-in 9600 PCR thermesche Cycler, Computer kontrolléiert 1 bis 2 Stonnen fir d'Verstäerkung an d'Quantifikatioun vun 96 Proben automatesch a synchron ze kompletéieren.④ Kee Bedierfnes fir Gelelektrophorese: Kee Grond fir d'Probe ze verdënnen an ze elektrophoreséieren, benotzt just eng speziell Sonde fir direkt am Reaktiounsröhre z'entdecken.⑤Keng Verschmotzung an der Pipeline: Déi eenzegaarteg voll zouene Reaktiounsröhre an de fotoelektresche Leedungssystem ginn ugeholl, sou datt et keng Suergen iwwer d'Verschmotzung ass.⑥ D'Resultater si reproduzéierbar: de quantitative dynamesche Beräich ass bis zu fënnef Uerderen vun der Gréisst.Dofir, well dës Technologie erfollegräich entwéckelt gouf, ass et vu ville wëssenschaftleche Fuerscher geschätzt a gouf a ville Beräicher applizéiert.
2 Prinzipien a Methoden
Den Aarbechtsprinzip vum FQ-PCR ass d'5′→3′ Exonuklease Aktivitéit vum Taq Enzym ze benotzen fir eng fluoreszent markéiert Sonde zum PCR Reaktiounssystem ze addéieren.D'Sonde kann spezifesch mat der DNA Schabloun hybridiséieren, déi an der Primer Sequenz enthale sinn.De 5'Enn vun der Sonde ass mam Fluoreszenz Emissiounsgen FAM (6-Carboxyfluorescein, Fluoreszenz Emissioun Peak bei 518nm) markéiert, an den 3'Enn ass mat der Fluoreszenz-Quenching-Grupp TAMRA (6-Carboxytetramethyl-Peak-rhodamine) Label (6-Carboxytetramethyl-Peakrhodence, 5-2-Fluorescence-Rhodamin, 8-2'n). Ginnung vun der Sonde gëtt phosphoryléiert fir ze vermeiden datt d'Sonde während der PCR Amplifikatioun verlängert gëtt.Wann d'Sond intakt bleift, ënnerdréckt d'Quencher-Grupp d'Fluoreszenz Emissioun vun der emittéierender Grupp.Wann déi emittéierend Grupp vun der Quenching-Grupp getrennt ass, gëtt d'Inhibitioun opgehuewen, an d'optesch Dicht bei 518nm erhéicht a gëtt duerch de Fluoreszenz-Detektiounssystem festgestallt.An der Renaturatiounsphase hybridiséiert d'Sond mat der Schabloun-DNA, an den Taq-Enzym an der Erweiderungsphase beweegt sech laanscht d'DNA-Schabloun mat der Erweiderung vun der Extensioun.Wann d'Sond ofgeschnidden ass, gëtt de Quenching-Effekt entlooss an de fluoreszent Signal entlooss.All Kéier wann d'Schabloun kopéiert gëtt, gëtt eng Sonde ofgeschnidden, begleet vun der Verëffentlechung vun engem fluoreszent Signal.Well et eng een-zu-een Relatioun tëscht der Unzuel vun de verëffentlechte Fluorophoren an der Unzuel vun de PCR Produkter ass, kann dës Technik benotzt ginn fir d'Schabloun präzis ze quantifizéieren.Den experimentellen Instrument benotzt allgemeng den ABI7100 PCR thermesche Cycler entwéckelt vun der PE Firma, an aner thermesch Cycler kënnen och benotzt ginn.Wann den ABI7700 Reaktiounstyp Reaktiounssystem fir den Experiment benotzt gëtt, nodeems d'Reaktioun ofgeschloss ass, kënnen déi quantitativ Resultater direkt duerch Computeranalyse ginn.Wann Dir aner thermesch Cyclers benotzt, musst Dir e Fluoreszenzdetektor benotzen fir de Fluoreszenzsignal an der Reaktiounsröhre gläichzäiteg fir RQ +, RQ-, △RQ ze berechnen.RQ + duerstellt d'Verhältnis vun der luminescence Intensitéit vun der fluorescent Emissioun Grupp vun der Prouf Rouer zu der luminescence Intensitéit vun der quenching Grupp, RQ- duerstellt d'Verhältnis vun deenen zwee an der eidel Rouer, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) duerstellt de Montant vun fluorescence Donnéeën Ännerung während PCR kritt fluorescence, kann no der fluorescence Prozess Ännerung.Duerch d'Aféierung vu fluoreszent Sonden gëtt d'Spezifizitéit vum Experiment wesentlech verbessert.D'Sonde Design soll allgemeng de folgende Konditiounen erfëllen: ① D'Längt vun der Sonde soll ongeféier 20-40 Basen sinn fir d'Spezifizitéit vun der Bindung ze garantéieren.②Den Inhalt vu GC Basen ass tëscht 40% an 60% fir Duplikatioun vun eenzel Nukleotid Sequenzen ze vermeiden.③ Vermeit Hybridiséierung oder Iwwerlappung mat Primer.④ D'Stabilitéit vun der Bindung tëscht der Sonde an der Schabloun ass méi grouss wéi d'Stabilitéit vun der Bindung tëscht dem Primer an der Schabloun, sou datt den Tm Wäert vun der Sonde op d'mannst 5 ° C méi héich ass wéi den Tm Wäert vum Primer.Ausserdeem hunn d'Konzentratioun vun der Sonde, d'Homologie tëscht der Sonde an der Schablounsequenz, an d'Distanz tëscht der Sonde an dem Primer all en Impakt op d'experimentell Resultater.
Zesummenhang Produkter:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Hiersteller a Fournisseur |Foregene (foreivd.com)
Post Zäit: Okt-15-2021
