A qPCR Experimenter ass Primer Design och e ganz wichtege Link.Ob d'Primeren gëeegent sinn oder net ass enk verbonne mat ob d'Verstäerkungseffizienz de Standard erreecht, ob déi amplifizéiert Produkter spezifesch sinn, an ob d'experimentell Resultater verfügbar sinn.
Also wéi qPCR Primer Spezifizitéit besser ze maachen?Héich Verstäerkungseffizienz?
Haut wäerte mir Iech huelen fir qPCR Primer zesummen ze designen, a loosse qPCR Primer Design eng effizient Lore Fäegkeet an Experimenter ginn.
Wann Dir qPCR Primer designt, gitt normalerweis op déi folgend Punkten opmierksam: Primer solle sou vill wéi méiglech iwwer Intronen entworf ginn, d'Produktlängt soll 100-300 bp sinn, den Tm-Wäert soll sou no wéi méiglech op 60 ° C sinn, an d'Upstream an Downstream Primer solle sou no wéi méiglech sinn, an d'Enn vum Primer sollt G C sinn, asw.
1. Design vun primers Spannend introns
Wann Dir qPCR Primer designt, kann d'Auswiel vu Primer entworf iwwer Intronen verhënneren datt d'gDNA Schabloun amplifizéiert gëtt, an d'Produkter sinn all ofgeleet vun der Amplifikatioun vu cDNA, sou datt den Afloss vun der gDNA Kontaminatioun eliminéiert gëtt.
2. Primer Längt
D'Primerlängt ass allgemeng tëscht 18-30 nt, an d'Längt vum Amplifikatiounsprodukt soll sou vill wéi méiglech tëscht 100-300 bp kontrolléiert ginn.
Wann de Primer ze kuerz ass, féiert et zu net-spezifesch Verstäerkung, a wann et ze laang ass, bilden se liicht sekundär Struktur (wéi Haarnadelstruktur).Wann d'Verstäerkungsprodukt ze laang ass, ass et net gëeegent fir d'Reaktioun vu Polymerase, wat d'Effizienz vun der PCR Amplifikatioun beaflosst.
3. GC Inhalt an Tm Wäert
D'GC Inhalt vun primers soll tëscht 40% an 60% kontrolléiert ginn.Wann et ze héich oder ze niddreg ass, ass et net förderlech fir d'Reaktioun ze initiéieren.D'GC Inhalt vun der vir an ëmgedréint primers soll no bei der selwechter ginn déi selwecht Tm Wäert an annealing Temperatur ze kréien.
Den Tm-Wäert soll sou wäit wéi méiglech tëscht 55-65°C leien, allgemeng ëm 60°C, an den Tm-Wäert vum Upstream an Downstream soll esou no wéi méiglech sinn, am léifsten net méi wéi 4°C.
4. Vermeiden auswielen A um 3′ Enn vun der Primer
Wann den 3′ Enn vum Primer net passend ass, ginn et grouss Differenzen an der Syntheseeffizienz vu verschiddene Basen.Wann déi lescht Basis A ass, kann et och Kettensynthese initiéieren och am Fall vu Mëssmatch, a wann déi lescht Basis T Wann ass, gëtt d'Effizienz vun der Mëssmatch Induktioun staark reduzéiert.Dofir, probéiert ze vermeiden A um 3′ Enn vum Primer ze wielen, an et ass besser fir T ze wielen.
Wann et e Sondeprimer ass, kann de 5′ Enn vun der Sonde net G sinn, well och wann eng eenzeg G-Basis mat der FAM fluoreszenter Reportergrupp ugeschloss ass, kann G och de fluoreszent Signal ausgeschalt vun der FAM-Grupp ausléisen, wat zu falschen negativen Resultater resultéiert.Erscheinen.
5. Basis Verdeelung
D'Verdeelung vun de véier Basen am Primer ass am léifsten zoufälleg, vermeit méi wéi 3 konsekutiv G oder C um 3' Enn, a méi wéi 3 konsekutivG oder C sinn einfach Koppelen an der GC-räicher Sequenzregioun ze generéieren.
6. D'Primer Design Regioun soll komplex sekundär Strukturen vermeiden.
Déi sekundär Struktur, déi vum eenzege Strang vum Amplifikatiounsprodukt geformt gëtt, beaflosst de glate Fortschrëtt vum PCR.Andeems Dir virauszegesinn ob et eng sekundär Struktur an der Zilsequenz am Viraus ass, probéiert dës Regioun am Design vu Primer ze vermeiden.
7. D'Primer selwer an tëscht de Primer solle probéieren opfolgend komplementär Basen ze vermeiden.
Et kann keng konsekutiv 4 Basis Komplementaritéit tëscht dem Primer selwer an dem Primer sinn.De Primer selwer däerf keng komplementär Sequenz hunn, soss wäert et sech selwer klappen fir eng Haarnadelstruktur ze bilden, wat d'Annealing Kombinatioun vum Primer an der Schabloun beaflosst.
Komplementär Sequenzen kënnen net tëscht Upstream an Downstream Primer existéieren.Komplementaritéit tëscht Primer wäert Primer-Dimer produzéieren, wat d'PCR-Effizienz reduzéiert an esouguer d'quantitativ Genauegkeet beaflosst.Wann d'Primer-Dimer an d'Hoernadelstrukturen onvermeidlech sinn, sollt de △G Wäert net ze héich sinn (soll manner wéi 4,5 kcal / mol sinn).
8. D'Primer verstäerken den Zilspezifesche Produkt.
D'ultimativ Zil vun der qPCR Detektioun ass d'Heefegkeet vum Zilgen ze verstoen.Wann net spezifesch Verstäerkung geschitt ass, wäert d'Quantifikatioun ongenau sinn.Dofir, nodeems d'Primer entworf sinn, musse se duerch BLAST getest ginn, an d'Spezifizitéit vun de Produkter gëtt an der Sequenzdatenbank verglach.
Als nächst hu mir de mënschleche GAS6 (Growth arrest specific 6) Gen als Beispill fir qPCR Primer ze designen.
01 Ufro Gen
Homo GAS 6duerch NCBI.Hei sollte mir oppassen fir den Gennumm an Arten ze vergläichen fir sécherzestellen datt se konsequent sinn.
02 Fannt d'Gensekvens
(1) Wann d'Zielsequenz genomesch DNA ass, wielt déi éischt, dat ass déi genomesch DNA Sequenz vum Gen.
(2) Wann d'Zielsequenz mRNA ass, wielt déi zweet.Nodeems Dir aginn hutt, klickt op "CDS" an der Tabell hei ënnen.Déi brong Hannergrond Sequenz ass d'Kodéierungssequenz vum Gen.
03 Design Primer
Gitt de Primer-BLAST Interface un
Gitt d'Gensekvensnummer oder d'Sequenz am Fasta-Format uewe lénks a fëllt déi relevant Parameteren aus.

Klickt op "Get primers" an NCBI erschéngt fir Iech ze soen datt esou Parameterauswiel op aner Splicingvarianten verstäerkt gëtt.Mir kënnen déi verschidde Splicingvarianten iwwerpréiwen a se ofginn fir de passende Primerpaar ze kréien (wéi an der Figur hei ënnen).Dëse Prozess kann Zénger vu Sekonnen huelen fir ze lafen.
D'annealing Temperaturen vun dëse Primer Pairen sinn all ronderëm 60 ° C.Laut dem Zweck vum Experiment, wielt Primer mat moderéierter Längt, gudder Spezifizitéit a manner Selbstkomplementatioun vun de Primer fir den Experiment, an den Erfollegsquote ass zimlech héich!
04 Primer Spezifizitéit Verifizéierung
Tatsächlech, nieft dem Design vun Primer, Primer-Blast kann och d'Primeren evaluéieren déi mir selwer entworf hunn.Zréck op d'primer Design Säit, gitt d'upstream an downstream primers mir entworf, an aner Parameteren ginn net ugepasst.Nodeems Dir ofginn hutt, kënnt Dir kucken ob d'Paar vu Primer och op aner Genen existéieren.Wann se all op dem Gen ugewise ginn, wëlle mir amplifizéiert, wat beweist datt d'Spezifizitéit vun dësem Pair vu Primer super ass!(Zum Beispill, dëst ass dat eenzegt Resultat vun der Primer Ufro!)

05 Primer Qualitéit Uerteel
Wéi eng Primer ass de "perfekte" Primer deen "Verstäerkungseffizienz bis zum Standard", "verstäerkte Produkteigenschaften" an "zouverlässeg experimentell Resultater" kombinéiert?
Amplifikatioun Effizienz

Schmelzkurve
D'Verstäerkungseffizienz vun de Primer erreecht 90% -110%, dat heescht datt d'Verstäerkungseffizienz gutt ass, an d'Schmelzkurve huet en eenzegen Héichpunkt an normalerweis Tm> 80 ° C, dat heescht datt d'Verstäerkungsspezifizitéit gutt ass.
 
Zesummenhang Produkter:
Echtzäit PCR Easy–SYBR GREEN I
Echtzäit PCR Easy-Taqman