1. Entdeckt d'Absorptioun vun der RNA Léisung
Absorptioun bei 280, 320, 230 an 260 nm representéiert d'Wäerter vun Nukleinsäure, Hannergrond (Léisungsturbiditéit), Salzkonzentratioun an organesch Matière wéi Protein, respektiv.Am allgemengen kuckt nëmmen op OD260 / OD280 (Verhältnis, R).Wann 1.8 ~ 2.0, mir mengen datt d'Kontaminatioun vu Protein oder aner organesch Matière an RNA toleréiert ka ginn, awer et sollt bemierkt datt wann Tris als Puffer benotzt gëtt fir d'Absorptioun z'entdecken, kann de R-Wäert méi grouss sinn wéi 2 (allgemeng sollt et <2.2 sinn).Wann R<1.8, ass d'Verschmotzung vu Protein oder aner organesch Matière an der Léisung méi offensichtlech, an d'Schicksal vun der RNA kann no de Besoinen bestëmmt ginn.Wann R> 2.2, heescht et datt RNA an eenzeg Nukleinsäure hydrolyséiert gouf.
2.Electrophoretic Muster vun RNA
Allgemeng gëtt denaturéierende Gel fir RNA Elektrophorese benotzt, awer wann et nëmmen ass fir d'Qualitéit vun RNA z'entdecken, ass denaturéierend Gel net néideg, an e gewéinleche Agarosegel ka benotzt ginn.Den Zweck vun der Elektrophorese ass d'Integritéit vun 28S an 18S Bands an hirem Verhältnis z'entdecken, oder d'Integritéit vum mRNA Schmier.Allgemeng, wann d'28S an 18S Bands hell, kloer a scharf sinn (bezunn op d'Kante vun de Bands kloer sinn), an d'Hellegkeet vun 28S ass méi wéi zweemol déi vun der 18S Band, betruechte mir d'Qualitéit vun der RNA als gutt.
Déi uewe genannte sinn déi zwou Methoden déi mir allgemeng benotzen, awer weder vun dësen zwou Methoden kënnen eis kloer soen ob et Rescht RNase an der RNA Léisung ass.Wann et eng ganz kleng Quantitéit un RNase an der Léisung ass, ass et schwéier fir eis et mat der uewe genannter Method z'entdecken, awer déi meescht vun de spéider enzymatesch Reaktiounen gi bei iwwer 37 Grad a fir eng laang Zäit duerchgefouert.Op dës Manéier, wann et eng ganz kleng Quantitéit vun RNase an der RNA Léisung ass, da gëtt et e ganz gëeegent Ëmfeld an Zäit fir hir Roll an de spéideren Experimenter ze spillen, an natierlech wäert d'Experiment zu dëser Zäit kal sinn.Drënner aféieren mir eng Method déi bestätegen kann ob et Rescht RNase an der RNA Léisung ass.
3. Hëtzt Erhaalung Test
No der Prouf Konzentratioun, molen zwee 1000 ng RNA aus der RNA Léisung a fügen se an engem 0,5 ml Zentrifuge Rouer, an ergänzen et mat pH 7,0 Tris Puffer zu engem Gesamtvolumen vun 10 ul, an dann Sigel de Kapp vun der Rouer.Setzt ee vun hinnen an e konstante Temperatur Waasserbad bei 70 ° C an halen et waarm fir 1 h.Deen aneren Deel gouf an engem -20°C Frigo fir 1 h gelagert.Wann d'Zäit eriwwer ass, huelt déi zwee Proben fir Elektrophorese.Nodeems d'Elektrophorese fäerdeg ass, vergläicht d'elektrophoretesch Bands vun deenen zwee.Wann d'Bands vun deenen zwee konsequent sinn oder kee wesentlechen Ënnerscheed hunn (natierlech erfëllen hir Bands och d'Konditioune vun der Method 2), heescht et datt et keng reschtlech RNase Kontaminatioun an der RNA Léisung ass, an d'Qualitéit vun der RNA ass ganz gutt.Am Géigendeel, wann d'Probe, déi bei 70 ° C inkubéiert ass, offensichtlech Degradatioun weist, beweist et datt et RNase Kontaminatioun an der RNA Léisung ass.
2 Experimentell Methoden an Technike fir RNA Extraktioun
D'Problemer déi mir dacks begéinen wann se RNA extrahéieren sinn: (1) RNA Ausbezuele ass niddereg;(2) RNA huet sérieux Salzverschmotzung;(3) RNA huet sérieux organesch Léisungsmëttelverschmotzung;(4) Probe Degradatioun an aner Problemer
1. Allgemeng benotzt total RNA Extraktiounsreagenz
D'Guanidin-Isothiocyanat-Methode an d'Trizol-Methode sinn déi meescht benotzt Methoden fir d'Extraktioun vun total RNA aus Déieregewebe an Déierenzellen.Et ass besonnesch gëeegent fir kleng Proben a Stoffer déi besonnesch schwéier ze extrahieren, sou wéi d'Extraktioun vun total RNA aus Kanéngchen Haut an Déier Bindegewebe;Zousätzlech, Trizol, als allgemeng Zweck Lysis reagent, kann och fir d'Extraktioun vun Planz Stoffer benotzt ginn, Bakterien, Fungi an aner Stoffer.Fir Planzengewebe mat Polysacchariden a Polyphenole, wéi Camellia oleifera, Téiblieder, Raps, etc., kann d'CTAB Method och benotzt ginn fir total RNA ze extrahieren.
Als konventionell Method ass d'Duebelkolonnmethod och ganz populär wéinst senger normaler Temperaturoperatioun, kee Besoin fir RNase ze addéieren, a Sécherheet - keng Chloroform, Phenolen an aner organesch Reagenz fir Extraktioun.(recommandéiert Produkter )
2. Extraktioun vun total RNA aus Déier Stoffer
(1) Probéiert frësch Tissue ze wielen, wann et net frësch ass (am léifsten innerhalb vun dräi Méint - 80 ℃ Frigo oder gefruer a flëssege Stickstoff. Wann Dir Tissue schneiden, net direkt bei Raumtemperatur schneiden, gitt sécher datt Dir et op d'Äiskëscht setzt, probéiert d'Wiederholung vum Gefrier an d'Verdauung ze vermeiden.
(2) Benotzt eng propper Schéier a Pinzette fir e klengt Stéck Tissue ze schneiden, probéiert den zentrale Deel vum Tissue ze schneiden wann Dir d'Probe schneiden, oder éischt d'grouss Stéck Tissue vun der Mëtt schneiden, a schneiden dann d'Probe an der frëscher Inzisionspositioun.D'geläscht Tissue soll komplett zerklengert ginn, setzen de zerklengert Tissu an en EP-Röhre ouni RNase, fügen d'Lysat derbäi, de gerappte Tissu soll komplett dem Lysat ausgesat sinn a virbereeden fir Homogeniséierung.
(3) Fir normal Stoffer, wielt Mung Bean-Gréisst Stoffer (30-60 mg) fir Homogeniséierung.Wann d'Tissue eng grouss Quantitéit u Protein, Fett oder dichte fibrous Stoffer wéi Liewer enthalen, passend d'Quantitéit u geschnidde Stoffer erhéijen oder erofsetzen (optional) Wielt 10 ~ 20 mg).
(4) Wann Fëschmuskel, Shrimp Fleesch, Jellyfish an aner Stoffer mat héije Waassergehalt extrahéiert ginn, sollt de Probevolumen entspriechend erhéicht ginn (recommandéiert 100-200 mg).
(5) Wann d'Konditioune et erlaben, kann d'Déiergewebe direkt extrahéiert ginn nodeems se mat engem Hochpassage Tissue Homogenisator homogeniséiert ginn, wann et keng sou Ausrüstung gëtt.
(6) D'RNA kritt no der Finale Extraktioun muss direkt op d'Äisbox plazéiert ginn fir d'Degradatioun vun der RNA ze reduzéieren.
3. Déier Zell RNA Extraktioun
(1) Suspensiounszellen: Zentrifuger direkt an entlooss de Medium, wäscht mat sterile PBS fir 1-2 Mol, suspendéiert dann mat enger entspriechender Quantitéit PBS, a füügt dann Lysat fir Lysis derbäi.Füügt d'Lysat net direkt un déi ausgefällt Zellen nodeems Dir d'Flëssegkeet komplett entlooss huet.Dëst wäert dozou féieren datt den Histon Package, deen no de lyséierten Zellen op der äusserer Schicht verëffentlecht gëtt, un d'Äussere vun den ausgefallenen Zellen hänken, an doduerch de Kontakt vun den Zellen an der Pellet mam Lysat limitéiert., wat zu onvollstänneg Zell-Lysis a reduzéierter RNA-Ausbezuelung resultéiert.
(2) Zellen déi semi-adherent sinn oder net enk adherent sinn: Nodeems Dir de Medium ewechgehäit hutt, wäscht mat PBS fir 1-2 Mol, absorbéiert dann direkt eng entspriechend Quantitéit vu PBS an bléist d'Kulturgeschir mat enger Pipette oder Pistoul fir d'Zellen ofzebriechen, a transferéiert se op RNA-fräi Zellen.Füügt de Lysat an d'EP-Röhre vum Enzym fir d'Extraktioun.
(3) Adherent Zellen: musse fir d'éischt mat Trypsin verdaut ginn, dann an RNase-gratis EP Réier gesammelt, centrifugéiert fir de Supernatant ze entfernen, 1-2 Mol mat PBS gewascht fir iwwerschësseg Trypsin ze entfernen, a resuspendéiert mat enger entspriechender Betrag vu PBS.
4. Plant RNA Extraktioun
Planzgewebe si reich an phenolesche Verbindungen, oder räich u Polysacchariden, oder enthalen e puer onidentifizéierte sekundär Metaboliten, oder hunn eng héich Aktivitéit vu RNase.Dës Substanze sinn enk mat RNA kombinéiert no der Zell-Lysis fir onléislech Komplexe oder kolloidal Ausfäll ze bilden, déi schwéier ze entfernen.Dofir, wa mir Planzengewebe extrahéieren, musse mir e Kit fir Planzen wielen.D'Lysat am Kit kann d'Problemer vun der einfacher Oxidatioun vu Polyphenolen an der Trennung vu Polysaccharidverbindungen an Nukleinsäuren effektiv léisen.
(Fir Polysaccharid Polyphenol Planz RNA Extraktioun, recommandéiert Produkter:
(1) D'Schiel, de Pulp, d'Somen, d'Blieder, asw.Wärend dem Schleifprozess sollt flëssege Stickstoff an der Zäit ersat ginn fir d'Probe ze schmëlzen.D'Buedemprobe soll séier an d'Lysat bäigefüügt ginn a gerëselt ginn fir d'RNA-Degradatioun ze vermeiden.
(2) Fir Faser-räiche Proben wéi Reis a Weessblieder, sollt d'Quantitéit vun der Extraktioun entspriechend reduzéiert ginn, soss wäerten d'Gewëssschleifen an d'Lysis net komplett sinn, wat zu enger gerénger Ausbezuelung vun extrahéierten RNA resultéiert.
(3) Fir Planzgewebe mat héije Waassergehalt, wéi Granatapfel Uebst, Waassermeloun Uebst, Peach Uebst, etc., soll d'Probegréisst entspriechend erhéicht ginn (100-200 mg ass fakultativ).
(4) Planzgewebe, wéi Planzenblieder, Rhizome, haart Uebst an aner Materialien sinn allgemeng recommandéiert fir flësseg Stickstoff ze benotzen fir d'Ingredienten an engem Mörser grëndlech ze mortéieren, a gitt dann op d'Extraktiounsstuf.Konventionell Tissuehomogenisatoren kënnen net effektiv sinn fir Planzengewebe ze homogeniséieren, a si meeschtens net recommandéiert.
5. Precautiounen fir RNA Extraktioun
(1) Tissue Echantillon solle sou frësch wéi méiglech sinn fir widderholl Afréiere an Ofdehnung ze vermeiden.
(2) Den Tissu soll während der Extraktioun voll gemoolt ginn, an d'Quantitéit vum Tissue soll net ze wéineg sinn, loosst eleng ze vill.
(3) Genuch Inkubatiounszäit sollt ginn nodeems de Lysat bäigefüügt gëtt fir d'Probe komplett ze lyséieren.
(4) Wann Dir d'Trizol-Methode fir d'Extraktioun benotzt, ass de Prinzip fir de Supernatant no der Stratifikatioun ze absorbéieren, "méi léiwer manner ze inhaléieren wéi méi ze inhaléieren", a däerf net an d'Mëttschicht extrahéieren, soss wäert et e seriöse genomesch DNA Kontaminatioun verursaachen.
(5) Wann Dir wäscht, sollt d'Wäschflëssegkeet ganz ronderëm d'Röhremauer infiltréieren fir eng grëndlech Wäschung ze garantéieren.
(6) Fir d'Kolonnextraktiounsmethod, zousätzlech fir d'Kolonn no der Wäschung z'entloossen, sollt d'Adsorptiounskolonne och an enger ultra-propper Bänk plazéiert ginn a fir 5-10 Minuten geblosen ginn, fir den organesche Léisungsmëttel op d'Trockheet komplett ze verdampen.
(7) Bei der leschter Elutioun vun der Kolonnmethod, nodeems Dir DEPC Waasser bäigefüügt huet, sollt et fir 3-5 Minutten inkubéiert ginn, oder d'DEPC Waasser soll am Viraus op 60 ° C erhëtzt ginn fir d'Elutiounsausbezuelen ze erhéijen.An der traditioneller Trizol Spaltung an Isopropanol Nidderschlagsmethod gëtt d'endgülteg RNA am DEPC Waasser opgeléist, sou datt eng entspriechend Zäit fir d'Opléisung gegeben gëtt, an de Buedem vum Zentrifugeröhre soll kontinuéierlech mat engem Pipette-Spëtz geblosen ginn.
3 TDräi Ursaachen a Léisunge fir niddereg RNA Konzentratioun / schlecht Qualitéit
1. D'Ausbezuelung ass ze niddreg
Déi extrahéiert Probe ass ze niddreg, de Gesamtbetrag ass net genuch, oder déi extrahéiert Probe ass ze vill an d'Lysis ass net komplett;d'Tissue oder Zellen vun passenden Qualitéit soll fir Extraktioun benotzt ginn, der Pre-Behandlung vun der Prouf muss gutt gemaach ginn, an der lysis soll genuch ginn.
2. Genom Reschter
Beim Extraktioun duerch Trizol Method, wann de Supernatant no der Schicht an d'Mëttschicht gesaugt gëtt, gëtt eng sérieux Genomkontaminatioun verursaacht;extra Suergfalt sollt beim Schichten geholl ginn fir net an d'Mëttschicht ze saugen.Wann d'Kolonnmethod fir Extraktioun benotzt gëtt, kann e Kit mat DNase I fir Extraktioun ausgewielt ginn.D'Nukleinsäure, déi op der Membran adsorbéiert ass, gëtt direkt mat DNase I verdaut, wat d'DNA-Reschter staark reduzéiere kann.
3. RNA Degradatioun
Et kann d'Degradatioun vun der extrahéierter Probe selwer sinn, oder d'Degradatioun, déi während dem Extraktiounsprozess verursaacht gëtt;sou wäit wéi méiglech, frësch Echantillon soll fir RNA Extraktioun benotzt ginn, an der gesammelt Echantillon soll am flëssege Stéckstoff oder -80 ° C Frigo an Zäit gespäichert ginn, a widderholl Afréiere an thawing soll vermeit ginn.RNase / DNase gratis Tipps, Zentrifuge Réier an aner Materialien sollen am RNA Extraktiounsprozess benotzt ginn.Den Extraktiounsprozess soll sou séier wéi méiglech sinn.Déi extrahéiert RNA soll op eng Äisbox plazéiert ginn a bei -80 an der Zäit gespäichert ginn.Wann d'extraitéiert RNA muss duerch Gelelektrophorese erkannt ginn, sollt d'Elektrophorese direkt no der Extraktioun ausgeführt ginn, an den Elektrophorese-Puffer soll mat engem nei preparéierten ersat ginn.
4. Salz an organesch Léisungsmëttelreschter
D'Extraktiounsreagens enthalen Phenol a Guanidinsalze, an d'Wäschléisung enthält Ethanol.Wärend dem Extraktiounsprozess gouf de Lysat net komplett absorbéiert a verworf, an d'Wäschléisung gouf net voll getrocknegt.Reschtsalze an organesch Léisungsmëttel si schiedlech fir spéider ëmgedréint Transkriptioun a PCR.Verschidde Grad vun Hemmung, sou datt de Tissuelysat während dem Extraktiounsprozess komplett ofgeschaaft gëtt, an d'Wäschung sollt genuch sinn, fir datt d'Ëmgéigend vum Rouer gewäsch ginn.Zousätzlech gëtt d'Röhre eidel gemaach a geblosen ass e noutwendege Schrëtt, wat de Rescht vun der organescher Matière weider reduzéiert.
Fir méi Informatiounen iwwer RNA Extraktioun, befollegt w.e.g. eis Websäit:
www.foreivd.com fir méi Informatiounen.
Post Zäit: Dez-01-2022
