PCR ass déi meescht benotzt Nukleinsäure Amplifikatiounstechnologie a gëtt wäit benotzt wéinst senger Empfindlechkeet a Spezifizitéit.Wéi och ëmmer, PCR erfuerdert widderholl thermesch Denaturatioun a kann net vun den Aschränkunge vun der Vertrauen op Instrumenter an Ausrüstung lass ginn, wat seng Uwendung am klineschen Feldtest limitéiert.

Zënter de fréien 1990er hunn vill Laboratoiren ugefaang konstant Temperaturverstärkungstechnologie ze entwéckelen déi keng thermesch Denaturatioun erfuerdert.Elo hu se Loop-mediéiert isothermesch Verstäerkungstechnologie entwéckelt, Strang Ersatz isothermesch Verstäerkungstechnologie, Rolling Circle isotherm Verstäerkungstechnologie, an Nukleinsäure Sequenz Ofhängegkeet.Isothermesch Verstäerkungstechnologie an aner Technologien. 

Loop-mediéiert isothermesch Amplifikatioun

Den Amplifikatiounsprinzip baséiert op der Tatsaach datt d'DNA an engem dynamesche Gläichgewiichtszoustand bei ongeféier 65 °C ass.Wann iergendeen Primer Base-gepaart ass an op de komplementären Deel vun der duebelstrenger DNA verlängert gëtt, trennt deen anere Strang sech a gëtt eenstrengeg.

Bei dëser Temperatur benotzt DNA 4 spezifesch Primer fir op eng Strang-Verschiebung DNA Polymerase ze vertrauen fir d'Synthese vu Strang-Verschiebung DNA kontinuéierlech selwer zirkuléieren ze maachen.

Éischt bestëmmen déi 6 spezifesch Regiounen F3, F2, F1, B1, B2, B3 op der Zil- Gen, an dann Design 4 primers baséiert op dëse 6 spezifesch Regiounen (wéi an der Figur ënnendrënner gewisen):

De Forward Inner Primer (FIP) besteet aus F1c an F2.

De Réck banneschten Primer (BIP) besteet aus B1c a B2, an TTTT gëtt als Spacer an der Mëtt benotzt.

Déi baussenzeg Primer F3 a B3 besteet respektiv aus F3 a B3 Regiounen um Zilgen.

Am LAMP Reaktiounssystem ass d'Konzentratioun vum banneschten Primer e puer Mol déi vum baussenzege Primer.Den banneschten Primer gëtt fir d'éischt mam Schablounstreng kombinéiert fir e komplementäre Strang ze synthetiséieren fir en DNA Duebelstreng ze bilden.Duerno gëtt de baussenzege Primer mam Schablounstreng kombinéiert fir en DNA Duebelstreng ze bilden.Ënnert der Handlung vu BstDNA Polymerase gëtt de komplementäre Strang synthetiséiert vum banneschten Primer verëffentlecht.No enger Serie vu Reaktiounen formt de komplementäre Strang endlech en eenzegen DNA Strang mat enger Hantelstruktur.

D'Hantelstruktur DNA Single Strang selwer gëtt als Schabloun benotzt fir kontinuéierlech eng Iwwergangsstam-Loop Struktur DNA mat engem oppene Enn ze bilden.Déi bannenzeg a baussenzeg Primer guidéieren d'Iwwergangs-Stamm-Loop Struktur DNA fir kontinuéierlech Strangverschiebung an Extensiounsreaktiounen z'ënnerhalen, a schliisslech verschidde Stamm-Loop Strukturen mat verschiddene Längt bilden.DNA Mëschung.

Virdeeler an Nodeeler vun der Loop-mediéierter isothermescher Amplifikatioun

Virdeeler vum LAMP:

(1) Héich Amplifikatiounseffizienz, déi effektiv 1-10 Exemplare vum Zilgen innerhalb vun 1h amplify kann, an d'Verstäerkungseffizienz ass 10-100 Mol déi vum gewéinleche PCR.

(2) D'Reaktiounszäit ass kuerz, d'Spezifizitéit ass staark, a keng speziell Ausrüstung ass erfuerderlech.

Mängel vu LAMP:

(1) D'Ufuerderunge fir Primer si besonnesch héich.

(2) De verstäerkte Produkt kann net fir Klonen a Sequenzéierung benotzt ginn, awer kann nëmme fir Uerteel benotzt ginn.

(3) Wéinst senger staarker Empfindlechkeet ass et einfach Aerosolen ze bilden, déi falsch Positiver verursaacht an d'Testresultater beaflossen.

STRAND Verréckelung amplification

Strand Displacement Amplification (SDA) ass eng in vitro isothermesch DNA Amplifikatiounstechnik baséiert op enzymatescher Reaktioun fir d'éischt vum amerikanesche Geléiert Walker am Joer 1992 proposéiert.

De Basissystem vun SDA enthält eng Restriktioun Endonuklease, eng DNA Polymerase mat Strangverschiebungsaktivitéit, zwee Pairen vu Primer, dNTPs, a Kalzium a Magnesiumionen a Puffersystemer.

De Prinzip vun der Strangverdrängung Amplifikatioun baséiert op der chemesch modifizéierter Restriktioun Endonuklease Unerkennungssequenz op béide Enden vun der Zil-DNA.D'Endonuklease mécht de Spalt an der Strang DNA op senger Unerkennungsplaz op, an d'DNA Polymerase verlängert de Spalt 3'End an ersetzt den nächsten DNA Strang.

Déi ersat eenzel Strécke vun DNA kënne mat Primer kombinéiert ginn an duerch DNA Polymerase an Duebelstrenge verlängert ginn.Dëse Prozess gëtt kontinuéierlech widderholl, sou datt d'Zielsequenz effizient verstäerkt gëtt.

Virdeeler an Nodeeler vun Sträng Verréckelung amplification Technologie

Virdeeler vum SDA:

D'Verstäerkungseffizienz ass héich, d'Reaktiounszäit ass kuerz, d'Spezifizitéit ass staark, a keng speziell Ausrüstung ass erfuerderlech.

Mängel vun SDA:

D'Produkter sinn net eenheetlech, an e puer Single-stranded an duebel-stranded Produkter sinn ëmmer am SDA Zyklus produzéiert, an tailing wäert zwangsleefeg geschéien wann duerch electrophoresis entdeckt.

Rolling Krees amplification

Rolling Circle Amplification (RCA) gëtt proposéiert andeems se op d'Methode vun der Kopie vun DNA vu pathogenen Organismen duerch Rolling Circle benotzt ginn.Et bezitt sech op d'Benotzung vun eenzel-stranded kreesfërmeg DNA als Schabloun bei enger konstanter Temperatur, an eng speziell DNA Polymerase (wéi Phi29) ) Ënnert der Aktioun vun Rolling Krees DNA Synthes fir d'Verstäerkung vun der Zil- Gen ze erreechen.

RCA kann a linear Verstäerkung an exponentiell Verstäerkung opgedeelt ginn.D'Effizienz vun linear RCA kann 10 erreechen⁵mol, an d'Effizienz vun exponentiellem RCA kann 10 erreechen⁹mol.

Einfach Ënnerscheedung, wéi an der Figur hei ënnendrënner gewisen, linear Amplifikatioun a benotzt nëmmen 1 Primer, exponentiell Amplifikatioun b huet 2 Primer.

Linear RCA gëtt och Single Primer RCA genannt.E Primer bindt sech un kreesfërmeg DNA a gëtt duerch d'Aktioun vun DNA Polymerase verlängert.D'Produkt ass e linear eenzege Strang mat enger grousser Zuel vu repetitive Sequenzen Tausende Mol d'Längt vun enger eenzeger Loop.

Zënter datt de Produkt vu linearem RCA ëmmer mam Startprimer verbonnen ass, ass déi einfach Fixéierung vum Signal e grousse Virdeel.

Exponentiell RCA, och bekannt als Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), an exponential RCA, ee Primer verstäerkt de RCA Produkt, den zweeten Primer hybridiséiert mam RCA Produkt a verlängert, an den Ersatz ass scho mam RCA Produkt gebonnen.

D'Virdeeler an Nodeeler vun Rolling Krees Nukleinsäure amplification

Virdeeler vum RCA:

Héich Empfindlechkeet, gutt Spezifizitéit an einfach Operatioun.

Mängel vun RCA:

Hannergrond Probleemer während Signalerkennung.Wärend der RCA Reaktioun kënnen déi onzirkuléiert Padlock Sonde an d'Schabloun DNA oder RNA vun der ongebonnener Sonde e puer Hannergrondsignaler generéieren. 

Nucleicacid Sequenz-baséiert Amplifikatioun

Nukleinsäure Sequenz-baséiert Amplifikatioun (NASBA) ass eng nei Technologie entwéckelt op Basis vu PCR.Et ass eng kontinuéierlech an isotherm Nukleinsäureamplifikatioun guidéiert vun engem Paar Primer mat enger T7 Promoteur Sequenz.D'Technologie kann d'Schabloun RNA ëm ongeféier 109 Mol an ongeféier 2 Stonnen verstäerken, wat 1000 Mol méi héich ass wéi déi konventionell PCR Method an erfuerdert keng speziell Ausrüstung.

Dës Technologie gouf fir eng séier Diagnostik vu Krankheeten benotzt soubal se erschéngt, a vill Firmen benotze momentan dës Method an RNA Detektiounskits.

Och wann d'RNA Amplifikatioun och ëmgedréint Transkriptioun PCR Technologie benotze kann, huet NASBA seng eege Virdeeler: et kann ënner relativ konstante Temperaturbedéngungen duerchgefouert ginn, an et ass méi stabil a präzis wéi traditionell PCR Technologie.

D'Reaktioun ass bei 41 Grad Celsius a erfuerdert AMV (Avian Myeloblastosis Virus) ëmgedréint Transkriptase, RNase H, T7 RNA Polymerase an e Paar Primer fir ze kompletéieren.

De Prozess ëmfaasst haaptsächlech:

De Forward Primer enthält déi komplementär Sequenz vum T7 Promoteur.Wärend der Reaktioun bindt de Forward Primer un den RNA Strang a gëtt vum AMV Enzym katalyséiert fir en DNA-RNA Duebelstreng ze bilden.

RNase H verdaut d'RNA an der Hybrid Duebelstreng a behält déi eenzegstrengeg DNA.

Ënnert der Handlung vum ëmgekéierte Primer an dem AMV Enzym gëtt eng DNA Duebelstreng mat der T7 Promoteur Sequenz geformt.

Ënnert der Handlung vun T7 RNA Polymerase gëtt den Transkriptiounsprozess ofgeschloss an eng grouss Quantitéit un Zil-RNA gëtt produzéiert.

Virdeeler vun NASBA:

(1) Säin Primer huet eng T7 Promoteur Sequenz, awer déi auslännesch duebelstrengend DNA huet keng T7 Promoteur Sequenz a kann net amplifizéiert ginn, sou datt dës Technologie héich Spezifizitéit a Sensibilitéit huet.

(2) NASBA integréiert direkt den ëmgedréint Transkriptiounsprozess an d'Verstäerkungsreaktioun, wat d'Reaktiounszäit verkierzt.

Nodeeler vun NASBA:

(1) D'Reaktiounskomponente si méi komplizéiert.

(2) Dräi Aarte vun Enzyme sinn erfuerderlech fir d'Reaktiounskäschte méi héich ze maachen.