RT-qPCR ass d'Basisexperiment vun der molekulare Biologie, a jidderee muss et vertraut sinn.Et enthält haaptsächlech dräi Schrëtt: RNA Extraktioun, ëmgedréint Transkriptioun an cDNA, an Echtzäit fluoreszent quantitativ PCR.Et hëlleft net, wat ass lass?Et ass wahrscheinlech, datt et e Problem matde ëmgedréint Transkriptiounsexperiment!Och wann et schéngt datt de ëmgedréint Transkriptiounsexperiment nëmmen RNA, dNTP, Primer aëmgedréint Transkriptaseop d'Zentrifuge Röhre a gutt vermëschen, awer am eigentleche Operatiounsprozess sinn et nach vill Detailer déi oppassen musse ginn.Loosst eis doriwwer léieren!

Wéi beurteelen ech d'Qualitéit vum RNA?
Fir cDNA ze kréien, ass d'Qualitéit vum RNA kritesch!D'RNA Qualitéit kann haaptsächlech aus zwee Aspekter festgestallt ginn:
(1) RNA Integritéit:RNA Integritéit kann duerch Agarose Gel Elektrophorese verifizéiert ginn. Eukaryoten als Beispill huelen, huet déi komplett total RNA dräi kloer Bands, d'Molekulargewiicht vu grousser bis kleng sinn 28S, 18S, an 5S, an 28S ass duebel sou hell wéi 18S;wann dräi Bands kënne gesi ginn, awer d'Bandtyp ass verschwonnt oder Diffusioun bedeit datt d'RNA deelweis ofgebaut ass.Zu dëser Zäit, maacht w.e.g. déi ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun direkt a vergréissert d'Schablouninput entspriechend;wann nëmmen eng Band mat engem klenge Molekulare Gewiicht oder keng Band ze gesinn ass, ass d'RNA komplett degradéiert a muss nei extrahéiert ginn.Agilent 2100 weist d'Integritéit vun RNA mat Peak Diagramm an RIN Wäert.Wann d'Nukleinsäure intakt ass, ass d'Basislinn vum Elektropherogramm flaach;wann d'Nukleinsäure schwéier degradéiert ass, ass d'Basislinn ongläich a méi Degradatiounspeaks erschéngen;de Wäert vum RIN reflektéiert d'Integritéit vun der RNA, am Beräich vun 0-10, wat méi grouss de Wäert ass, wat besser d'Qualitéit vun der RNA.Gutt, wat méi héich ass de Grad vun der Vollständegkeet.
(2) Rengheet vum RNA:D'Verhältnis vun OD260/280 kann duerch UV Spektrofotometrie festgestallt ginn.Wann d'Verhältnis vun OD260/280 tëscht 1,9 an 2,1 ass, ass d'Rengheet ganz gutt.
Restgenomesch DNA kann zu ongenaue quantitative Resultater féieren
Wann RNA extrahéiert gëtt, kann d'RNA, déi mir kréien, mat genomesch DNA (gDNA) gemëscht ginn, déi net gebotzt gouf.Dofir gëtt d'cDNA no ëmgedréint Transkriptioun och gemëscht matgDNA.Während dem DownstreamqPCRReaktioun,cDNAa gDNA kann gläichzäiteg verstäerkt ginn, wat zu engem relativ klenge CT Wäert resultéiert, sou datt d'Resultater partiell sinn.
Also wat solle mir an dëser Situatioun maachen?Virdrunproposéiert:
(1) Maacht Genom Botzen op der ëmgedréint RNA, déi duerch Kolonnextraktioun wärend der RNA Extraktioun ewechgeholl ka ginn;
(2) Behandelt déi extrahéiert RNA mat DNaseI , mee terminéiert et mat EDTA;
vun ëmgedréint Transkriptioun reagentsmat Genome Clearing Moduler;

Wéi wielen ech Primer fir ëmgedréint Transkriptioun?
Reverse Transkriptiounsprimer beaflossen och d'Resultat vun der ëmgedréiter Transkriptiounsreaktioun.Dir kënnt zoufälleg Primer wielen, Oligo dT oder genspezifesch Primer fir ëmgedréint Transkriptioun no de spezifesche Ëmstänn vum Experiment:
(1) Spezifesch Transkriptiounen: Gen-spezifesch Primer ginn recommandéiert;
(2) Laang Fragment Transkriptiounen: Oligo dT / Gen-spezifesch Primer ginn recommandéiert;
(3) Intern Fragmenter vu laange Segment Transkriptiounen: Gen-spezifesch primers / zoufälleg primers / zoufälleg primers + Oligo dT.Wann de spéideren qPCR Experiment gemaach gëtt, kann Oligo dT net eleng benotzt ginn, well d'Oligo dT eleng benotzt ka 3 'Enn Bias verursaachen, wat zu ongenaue qPCR Experimentresultater féiert;
(4) miRNA: Stamm-Loop-Primer oder tailing Primer kënne benotzt ginn.

Wéi oft soll de ëmgedréint Transkriptiounsprodukt cDNA fir Quantifikatioun verdünnt ginn?
Nodeems Dir d'cDNA vum ëmgedréint Transkriptiounsprodukt kritt hutt, ass wéivill Mol d'cDNA fir qPCR Experimenter verdünnt ass ganz wichteg.Wann d'cDNA Konzentratioun ze héich oder ze niddreg ass, kann d'Verstäerkungseffizienz beaflosst ginn.Kann d'cDNA Konzentratioun gemooss ginn, a wéi soll et gemaach ginn?
(1) D'cDNA Konzentratioun vum ëmgedréint Transkriptiounsprodukt kann net gemooss ginn, well nieft dem cDNA Produkt enthält de Récktranskriptiounsprodukt och ëmgedréint Transkriptiounsresidbuffer, ëmgedréint Transkriptase, Primer, asw., wat d'Konzentratiounsmessresultater stéieren an OD260/280 verursaachen, OD260/260 reflektéiert net anormal an dofir reflektéiert cD260 net richteg.Zu dëser Zäit soen e puer Frënn, da wäert ech d'Konzentratioun no der Reinigung moossen;hei, Foregene géif gären drun erënneren, datt d'cDNA net recommandéiert ass ze purifizéieren, well d'Längt vun der cDNA kritt vun der reversal anescht ass, an der kuerz cDNA wäert an der Offäll verluer ginn.
(2) Also wat ze maachen?Virun dem qPCR Experiment kann de Verdünnungsgradient vum cDNA duerch de Pre-Experiment bestëmmt ginn.Zum Beispill: benotzt cDNA Stammléisung, 10-fache Verdünnung, an 100-fache Verdünnung als Schabloune fir qPCR Experimenter, a wielt de Verdünnungsfaktor mat engem CT-Wäert am Beräich vun 18-28.

Wéi soll miRNAs ëmgedréint transkribéiert ginn?
miRNA ass eng eenzegstrengeg kleng Molekül RNA mat enger Gréisst vun ongeféier 22 nt déi net fir Protein codéiert.Wéinst senger kuerzer Längt ass konventionell qPCR Method schwéier et direkt ze quantifizéieren, also ass et dacks néideg fir miRNA ze verlängeren;déi allgemeng benotzt ëmgedréint Transkriptiounsmethoden fir miRNA enthalen Stamm-Loop-Method an tailing-Method.
D'Stamm-Loop Method ass d'MiRNA ze verlängeren andeems Stamm-Loop Primer bäigefüügt ginn.Dës Detektiounsmethod huet méi héich Sensibilitéit a Spezifizitéit, awer den Detektiounsduerchgang ass niddereg.Eng ëmgedréint Transkriptioun kann nëmmen eng miRNA an eng intern Referenz erkennen;D'Schwänz-Addéierungsmethod besteet aus zwee Et gëtt ofgeschloss duerch d'gemeinsame Handlung vun zwee Enzyme, déi PolyA Polymerase a Reverse Transkriptase sinn.PolyA Polymerase ass verantwortlech fir PolyA Schwänz zu miRNA ze addéieren fir seng Längt ze erhéijen, an ëmgedréint Transkriptase mécht ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun.Dës Method huet héich Detectioun Débit a kann MÉI miRNAs an intern Referenze an engem ëmgedréint Transkriptiouns entdecken, mä d'Sensibilitéit an Spezifizitéit sinn niddereg an der Stamm-Loop Method.