PCR, multiple PCR, In situ PCR, Ëmgedréit PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Mir sortéieren d'Konzepter, Schrëtt an Detailer vu verschiddene PCR aus

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, bezeechent als PCR, ass eng molekulare biologesch Technologie déi benotzt gëtt fir spezifesch DNA Fragmenter ze vergréisseren.Et kann als eng speziell DNA Replikatioun in vitro ugesi ginn.DNA Polymerase (DNA Polymerase I) gouf als fréi wéi 1955 entdeckt, a Klenow Fragment vun E. Coli, déi experimentell Wäert a Praktikitéit huet, gouf vum Dr H. Klenow an de fréien 1970er entdeckt, awer well dëst Enzym d'Temperatur net toleréiert, kann d'Héichtemperatur et degeneréieren, sou datt et net mat der Polymerase-Kettenreaktioun entsprécht.D'Enzymen, déi haut benotzt ginn (genannt Taq Polymerase), goufen aus Thermus aquaticus isoléiert, eng waarm Quell Bakterie am Joer 1976. Seng Charakteristik ass datt et héich Temperaturen widderstoen kann an en idealen Enzym ass, awer et gëtt no den 1980er Jore vill benotzt.D'Original Konzept vun der Original primitive Prototyp vun PCR ass ähnlech ze Genreparatur a Kopie, déi vum Dr KJell Kleppe proposéiert gouf 1971. Hien huet déi éischt einfach a kuerzfristeg Genkopie publizéiert (ähnlech wéi déi éischt zwee Zyklusreaktiounen vu PCR).D'PCR haut entwéckelt gouf vum Dr Kary B. Mullis entwéckelt an 1983. Dr Mullis zerwéiert PE Firmen dat Joer, sou PE huet e spezielle Status an der PCR Industrie.Dr Mullis publizéiert offiziell déi éischt Zesummenhang Pabeier mat Saiki an anerer am 1985. Zënter deem ass d'Benotzung vun PCR Dausende vu Kilometer pro Dag, an d'Qualitéit vun Zesummenhang Aarbechten kann gesot ginn, vill aner Fuerschung Methoden unpalatable ze maachen.Duerno gëtt PCR Technologie wäit an der biologescher wëssenschaftlecher Fuerschung a klinescher Uwendungen benotzt, a gëtt déi wichtegst Technologie vun der molekulare Biologiefuerschung.De Mullis huet och den 1993 Nobelpräis an der Chimie gewonnen.

PCRPrinzip

De Basisprinzip vun der PCR Technologie ass ähnlech wéi den natierleche Replikatiounsprozess vun der DNA, a seng Spezifizitéit hänkt vum Oligonukleotidprimer of, dee komplementär ass zu béiden Enden vun der Zilsequenz.PCR besteet aus Degeneratioun-Annealing-Verlängerung dräi Basisreaktiounsschrëtt: ①Degeneratioun vun der Schabloun DNA: Nodeems d'Schabloun DNA fir eng gewëssen Zäit op ongeféier 93 ° C erhëtzt ass, gëtt d'Dual DNA Léisung fir d'Dual-Chain DNA geformt duerch d'PCR Verstäerkung vun der Schabloun DNA Leaving, maachen et eng eenzeg Kette mat der nächster Reaktioun fir d'Primerreaktioun ze preparéieren.②D'Annealing (Verbindung) vun der Schabloun DNA an dem Primer: Nodeems d'Schabloun DNA erhëtzt an an eng eenzeg Kette degeneréiert ass, fällt d'Temperatur op ongeféier 55 °C.Déi komplementär Sequenz vum Primer an der Schabloun DNA Single-Chain.③D'Verlängerung vum Primer: DNA Schabloun - d'Primerbindung baséiert op der Handlung vun TaqDNA Polymerase, mat dNTP als Reaktiouns Rohmaterial.Halt de Prinzip vun der Replikatioun, synthetiséiert eng nei semi-reservéiert Kopie Kette déi d'Schabloun DNA Kette ergänzen, a widderhuelen Zyklus Degeneratioun-Annealing-Extensioun dräi Prozesser kënne méi "semi-reservéiert Kopie Kette" kréien, an dës nei Kette ass erëm verfügbar Gitt eng Schabloun fir den nächsten Zyklus.Et dauert 2-4min fir d'Loop ofzeschléissen, den Zilgen kann e puer Millioune mol an 2-3 Stonnen verstäerkt ginn.

StandardPCRReaktioun System

Fënnef Elementer vun der PCR Reaktioun

Et gi haaptsächlech fënnef Aarte vu Substanzen, déi an der PCR Reaktioun involvéiert sinn, nämlech Primer, Enzym, dNTP, Schabloun a Puffer (Mg2+ ass erfuerderlech).[PCR Prozedur]

De Standard PCR Prozess ass an dräi Schrëtt opgedeelt

1. DNA Degeneratioun (90 ° C-96 ° C): Dual-Kette DNA Schablounen ënner thermesch Aktioun, Waasserstoff Obligatiounen Paus, eng Single-Kette DNA bilden.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): D'Systemtemperatur gëtt reduzéiert, de Primer gëtt mat der DNA Schabloun kombinéiert fir eng lokal Dual-Chain ze bilden.

3. Verlängerung (70℃ -75℃): Ënnert der Handlung vum Taq Enzym (ongeféier 72°C, déi bescht Aktivitéit), gëtt dNTP als Rohmaterial benotzt, aus dem 5′ Enn vum Primer → 3′ Enn, Synthese a Schabloun ergänzen all aner DNA Kette.

All Zyklus gëtt denaturéiert, annealéiert a verlängert, verduebelt den DNA Inhalt.Am Moment, wéinst dem kuerzen Amplifikatiounsgebitt, kann e puer PCR an enger ganz kuerzer Zäit replizéiert ginn, och wann d'Taq Enzymaktivitéit net optimal ass, sou datt et op zwee Schrëtt geännert ka ginn, dat ass, d'Annealing an d'Verlängerung kënne bei 60 ° C-65 ° C zur selwechter Zäit gemaach ginn.Fir de Prozess vum Hebe a Killmëttel ze reduzéieren an d'Äntwertgeschwindegkeet ze verbesseren.

PCR Reaktioun Fonctiounen

● High-Spezifizitéit

Déi spezifesch entscheedend Faktore vun der PCR Äntwert sinn: ①Déi spezifesch Kombinatioun vum Primer an der Schabloun DNA.②De Prinzip vun der Basispaarung.③ D'Loyalitéit vun der TaqDNA Polymerase Synthese Reaktioun.④ D'Spezifizitéit an d'Konservativitéit vum Zilgen.

Déi richteg Kombinatioun vu Primer a Schablounen ass de Schlëssel.D'Bindung vum Primer an der Schabloun an d'Verlängerung vun der Primerkette baséieren op de Prinzip vun der alkalescher Base Matching.D'Loyalitéit vu Polymerase-Synthese-Reaktiounen an d'Héichtemperaturresistenz vun der Taq DNA-Polymerase fir d'Bindung (Verbindung) vun der Schabloun a Primer an der Reaktioun ze maachen, kann bei enger méi héijer Temperatur gemaach ginn.D'Spezifizitéit vun der Kombinatioun ass staark erhéicht.De Clip kann en héije Grad vu Richtegkeet behalen.Andeems Dir eng Zilgenetesch Regioun mat héijer Konservativitéit an héijer Konservativitéit auswielen, ass seng Spezifizitéit méi héich.

● Héich Empfindlechkeet

De Produktiounsvolumen vu PCR Produkter gëtt duerch Index erhéicht, wat d'Startschabloun vum Picker (PG = 10-12) ausbaue kann fir den Niveau vum Mikrokontroller op den Niveau vu Mikrogramm (μg = -6) ze erhéijen.Eng Zilzellen kënnen aus 1 Millioun Zellen erkannt ginn;an der Detektioun vu Viren kann d'Sensibilitéit vu PCR 3 RFUs erreechen (eidel Flecken geformt Eenheeten);de Minimum Detektiounsquote an der Bakteriewëssenschaft ass 3 Bakterien.

● Einfach a séier

D'PCR Reflexioun benotzt eng Héichtemperatur Taq DNA Polymerase, déi d'Reaktiounsléisung gläichzäiteg bäidréit, dat heescht eng Degeneratioun-anneal-Extensiounsreaktioun op der DNA Amplifikatiounsléisung a Waasserbadpot.Allgemeng ass d'Verstäerkungsreaktioun an 2 bis 4 Stonnen ofgeschloss.Augmentéiert Produkter ginn allgemeng duerch elektresch Schwäert analyséiert, a musse keng Isotopen benotzen, keng radioaktiv Verschmotzung, an einfach Promotioun.

● D'Rengheet vum Exemplar ass niddereg

Et ass net néideg Viren oder Bakterien a Kulturzellen ze trennen.DNA rau Produkter an RNA kënnen als Verstärker benotzt ginn.DNA Amplifikatioun Detektioun kann direkt mat klineschen Exemplare benotzt ginn wéi Blutt, Kierperflëssegkeet, Hustwäschflëssegkeet, Hoer, Zellen a Liewewiesen.

PCRgemeinsam Problemer

● Falsch negativ, keng verstäerkte Bands

D'Schlësselstadien vun der PCR Reaktioun enthalen: ① Virbereedung vun Template Nukleinsäuren, ② Qualitéit a Spezifizitéit vu Primer, ③ Qualitéit vun Enzymen ④ PCR Zyklusbedéngungen.De Grond ze fannen soll och fir déi uewe genannte Linken analyséiert a studéiert ginn.

Schablounen: ① D'Schabloun enthält verschidde Proteinen, ② D'Schabloun enthält en Taq Enzyminhibitor, ③ D'Protein an der Schabloun gëtt net eliminéiert, besonnesch d'Gruppprotein am Chromosom.⑤ Deminer Nukleinsäure Degeneratioun ass net grëndlech.Wann d'Qualitéit vun Enzymen a Primer gutt sinn, gëtt et keng Amplifikatiounsband, wat héchstwahrscheinlech d'Verdauungsbehandlung vu Exemplare ass.Et ass eppes falsch mam Template Nukleinsäure Extraktiounsprozess, also fir eng effektiv a stabil Verdauungsléisung ze preparéieren, sollt seng Prozedur fixéiert ginn an net arbiträr geännert ginn.

Enzyminaktivéierung: en neit Enzym oder béid al an nei Enzyme solle zesumme benotzt ginn fir ze analyséieren ob d'Enzymaktivitéit verluer oder net genuch ass, wat zu falschen Negativer féiert.Et sollt bemierkt datt Taq Enzym oder Ethidiumbromid heiansdo vergiess gëtt.

Primer: d'Qualitéit vum Primer, d'Konzentratioun vum Primer, an ob d'Konzentratioun vun den zwee Primer symmetresch ass.Et ass e gemeinsame Grond fir de PCR Echec oder d'Erhéijung vun der Band ass net ideal an ufälleg fir ze diffuséieren.Et gi Probleemer mat der Qualitéit vun de Primer vun e puer Batchnummeren.Déi zwee Primer hunn eng héich Konzentratioun an eng niddreg Konzentratioun, verursaacht niddereg-Effizienz asymmetresch Amplifikatioun.D'Géigemoossname sinn: ① Wielt e gudde Primer fir Eenheeten ze synthetiséieren.② D'Konzentratioun vum Primer hänkt net nëmmen vum OD Wäert of, awer bezilt och op d'originell Flëssegkeet vum Primer fir Agar Zockergel Elektrophorese ze maachen.Et muss eng primer Sträif Zone ginn, an der Hellegkeet vun den zwee primers soll allgemeng konsequent ginn.Rimm, PCR kann zu dëser Zäit versoen, an et soll mat der Primer Synthese Eenheet geléist ginn.Wann e Primer héich ass, ass d'Hellegkeet niddereg, a seng Konzentratioun muss ausgeglach sinn wann se verdünnt sinn.③ De Primer soll bezuelt ginn a bei enger héijer Konzentratioun gespäichert ginn fir multiple Afréiere oder laangfristeg Kältedeeler vum Frigo ze vermeiden, wat de Primer verschlechtert an ofbaut.④ Den Design vum Primer ass onverständlech, sou wéi d'Längt vum Primer net genuch ass, an den Di Cluster gëtt tëscht de Primer geformt.

Mg2 + Konzentratioun: Mg2 + Ion Konzentratioun huet e groussen Impakt op PCR Amplifikatioun Effizienz.Exzessiv Konzentratioun kann de Géigendeel Geschlecht vun der PCR Amplifikatioun reduzéieren.Wann d'Konzentratioun ze niddreg ass, wäert de PCR Verstäerkung Output souguer de PCR Verstäerkung Echec ouni Expansioun Band maachen.

Ännerung vum Reaktiounsvolumen: De Volume, deen an der PCR Amplifikatioun benotzt gëtt, ass 20ul, 30ul, an 50ul oder 100uL, de grousse Volume vun der Uwendung fir PCR Verstäerkung gëtt no verschiddenen Zwecker vun der wëssenschaftlecher Fuerschung a klinescher Tester festgeluecht.Nodeems Dir kleng Bänn wéi 20ul gemaach hutt, ass et néideg fir e Schnurbedingung ze maachen wann Dir d'Gréisst maacht, soss wäert et versoen.

Kierperlech Grënn: Transformatioun ass ganz wichteg fir PCR Amplifikatioun.Wann d'Degeneratiounstemperatur niddereg ass, ass d'Degeneratiounszäit kuerz, et ass méiglecherweis a falsch Negativer optrieden;ze niddreg annealing Temperatur kann Net-spezifesch amplification Ursaach a spezifesch amplification Effizienz reduzéieren.Héich Afloss op d'Kombinatioun vu Primer a Template fir PCR Amplifikatiounseffizienz ze reduzéieren.Heiansdo ass et néideg Standard Thermometeren ze benotzen fir d'Verännerlechkeet, d'Annealung an d'Verlängerung vun der Temperatur an der Verlängerung oder Waasserlöslecher Kach ze entdecken, wat ee vun de Grënn fir de Versoen vum PCR ass.

Zilsequenzvarianten: Wann d'Zielsequenz geschitt ass, eng Mutatioun oder Läschung, gëtt d'Kombinatioun vum Prototyp an der Schabloun kombinéiert, oder wéinst dem Mangel vun enger Zilsequenz, verléieren de Primer an d'Schabloun déi komplementär Sequenz, a seng PCR Amplifikatioun wäert net erfollegräich sinn.

● Falsch positiv

D'PCR Amplifikatiounsband erschéngt konsequent mat der Zilsequenzband, an heiansdo ass seng Band méi ordentlech a méi héich.

Primer Design ass net gëeegent: déi gewielte Amplifikatioun Sequenz an net Zweck Amplifikatioun Sequenz hunn homolog, also wann PCR Amplifikatioun, sinn déi amplifizéiert PCR Produkter net Zweck Sequenzen.D'Zielsequenz ass ze kuerz oder de Primer ass ze kuerz, an et ass ufälleg fir falsch positiv.Muss nei entworf ginn.

Kräizverschmotzung vun Zilsequenz oder Amplifikatiounsprodukter: Et ginn zwee Grënn fir dës Verschmotzung: Éischtens, Kräizverschmotzung vum ganze Genom oder grousse Segmenter, wat zu falsche Positiven féiert.Dës Zort vu falschen Positiven kann duerch déi folgend Methoden geléist ginn: Sidd virsiichteg a sanft wärend der Operatioun fir ze verhënneren datt d'Zielsequenz an d'Probe Pistoul inhaléiert oder aus dem Zentrifugalröhre spritzt.Ausser Enzymen a Substanzen déi net héich Temperaturen ausstoen, sollen all Reagenz oder Ausrüstung mat héijen Drock desinfizéiert ginn.Zentrifugalleitungen a Proben solle gläichzäiteg benotzt ginn.Wann néideg, ier Dir Exemplare bäidréit, ginn d'Reaktiounsröhre an de Reagens un ultraviolette Strahlen ausgesat fir déi existent Nukleinsäure ze zerstéieren.Zweetens, kleng Fragmenter an der Loftverschmotzung.Dës kleng Fragmenter si méi kuerz wéi d'Zielsequenz, awer si hu gewësse Homologie.Et kann matenee gespléckt ginn.No der Ergänzung vun de Primer kann de PCR-Produkt erweidert ginn, wat eng falsch positiv Produktioun verursaacht.Et kann benotzt ginn fir d'Nest PCR Method ze reduzéieren oder ze eliminéieren.

● Schéngen nonspecific amplification Band

D'Bands, déi no der PCR-Verstäerkung erschéngen, sinn inkonsequent mat der erwaarter Gréisst, oder grouss oder kleng, oder zur selwechter Zäit, oder zur selwechter Zäit, spezifesch Amplifikatiounsbands an net-spezifesch Amplifikatiounsbands.D'Entstoe vun net spezifesche Bands ass: Éischtens sinn d'Primer onkomplett komplementär zu der Zilsequenz, oder d'Polymeriséierung vum Primer fir en Di Cluster ze bilden.Déi zweet ass datt d'Konzentratioun vu MG2 + Ionen ze héich ass, d'Annealtemperatur ze niddreg ass, an d'Zuel vun de PCR Zyklen ass verwandt.Zweetens, d'Qualitéit an d'Quantitéit vun Enzymen.Dacks sinn Enzyme vun e puer Quellen ufälleg fir net-speziell Bands an d'Enzyme vun der anerer Quell sinn net geschitt.Heiansdo geschitt net spezifesch Amplifikatioun vun Enzymen och.D'Géigemoossname sinn: nei entworf Attraktivitéit wann néideg.Reduzéiert d'Quantitéit vum Enzym oder ersetzt den Enzym vun enger anerer Quell.Reduzéieren der Quantitéit vun Primärschoul, Erhéijung der Quantitéit vun Template passenden, a reduzéieren d'Zuel vun Zyklen.Richteg Erhéijung vun der annealing Temperatur oder benotzen déi zwee Temperatur Punkt Method (93 ° C Degeneratioun, annealing an verlängeren op ongeféier 65 ° C).

● Erschéngen flaky Seel oder Schmierband

PCR Verstäerkung schéngt heiansdo applizéiert oder geschuel oder Teppech-ähnlechen Gürtel ze ginn.Aus dem Grond, wéinst der exzessiver Quantitéit vun Enzymen oder der schlechter Qualitéit vum Enzym, ass d'dNTP Konzentratioun ze héich, d'Mg2+ Konzentratioun ass ze héich, d'Annealtemperatur ass ze niddreg, an d'Zuel vun den Zyklen ass ze vill.D'Géigemoossname sinn: ①Reduktioun vun der Quantitéit vun Enzymen, oder änneren den Enzym vun enger anerer Quell.②D'Konzentratioun vun dNTP reduzéieren ③Mg2+ Konzentratioun richteg reduzéieren.④ Erhéije d'Quantitéit vun de Templates a reduzéiert d'Zuel vun den Zyklen.

Zesummenhang Produkter

PCR Heroᵀᴹ (Mat Faarf)

◮ Méi héich Vertrauen: 6 Mol déi vum gewéinleche Taq Enzym;

◮ Méi séier Verstäerkungsgeschwindegkeet

◮ Méi Template Adaptabilitéit

◮ Méi héich Verstäerkungseffizienz

◮ Ëmwelttoleranz ass méi staark: plazéiert bei 37 ° C fir eng Woch, behalen méi wéi 90% Aktivitéit;

◮ Et huet 5'→3' DNA Polymerase Aktivitéit an 5'→3' Exonuclease Aktivitéit, ouni 3'→5' Exonuclease Aktivitéit.

PCR Easyᵀᴹ (Mat Faarf)

Den eenzegaartege Reaktiounssystem an héicheffizienten Taq DNA Polymerase maachen d'PCR Reaktioun méi héich Amplifikatiounseffizienz, Spezifizitéit a Sensibilitéit.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ One-Step Kit mécht ëmgedréint Transkriptioun a qPCR zwou Reaktiounen am selwechte Rouer, brauche nëmmen Schabloun RNA, spezifesch PCR Primer an RNase-Free ddH derbäi ze ginn₂O.

◮ De Kit ka séier an effizient quantitativ viral RNA analyséieren oder RNA Spueren.

◮ De Kit benotzt en eenzegaartege Foregene Reverse Transkriptiounsreagens a Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinéiert mat engem eenzegaartege Reaktiounssystem fir effektiv d'Verstäerkungseffizienz a Spezifizitéit vun der Reaktioun ze verbesseren.

◮ Den optimiséierte Reaktiounssystem mécht d'Reaktioun méi héich Detektiounsempfindlechkeet, méi staark thermesch Stabilitéit a besser Toleranz.

◮ RT-qPCR Einfach^TM(One Step) -SYBR Green ech Kit kënnt mat ROX intern Referenz Dye, déi benotzt kënne Signal Hannergrond an Signal Feeler tëscht Wells eliminéiert ginn, déi bequem ass fir Clienten a verschiddene Modeller vun quantitativ PCR Instrumenter ze benotzen.

RT Einfach^TMII (Master Premix fir éischt-Sträng cDNA Synthese firEchtzeit PCR)

-Effektiv Fäegkeet fir gDNA ze läschen, wat gDNA an der Schabloun bannent 2 Minutten ewechhuelen kann.

-Effektiv ëmgedréint Transkriptiounssystem, et dauert just 15 Minutten fir d'Synthese vum éischte Strang cDNA ofzeschléissen.

-Komplex Templates: Templates mat héijen GC Inhalt a komplexer sekundärer Struktur kënnen och mat héijer Effizienz ëmgedréit ginn.

-High-Sensitivitéit ëmgedréint Transkriptiounssystem, pg-Niveau Template kënnen och héichqualitativ cDNA kréien.

-De Reverse Transkriptiounssystem huet héich thermesch Stabilitéit, déi optimal Reaktiounstemperatur ass 42 ℃, an et huet nach ëmmer gutt ëmgedréint Transkriptiounsleeschtung bei 50 ℃.