Spezifizitéit vun Detektioun
An de meeschte Fäll ass den Zweck vum Primer Design d'Spezifizitéit vum PCR ze maximéieren.Dëst gëtt bestëmmt duerch de méi oder manner prévisibelen Afloss vu ville Variablen.Eng wichteg Variabel ass d'Sequenz um 3′Enn vum Primer.
Wichteg ass, datt PCR Assays entworf fir Spezifizitéit méi wahrscheinlech héich Effizienz iwwer eng breet dynamesch Palette behalen, well den Assay keng net spezifesch Amplifikatiounsprodukter produzéiert, doduerch mat PCR Reagenser konkurréiere oder d'Haapt Amplifikatiounsreaktioun hemmt.
Natierlech, an e puer Fäll, Spezifizitéit ass net dat Wichtegst, zum Beispill, wann d'Zil ass eng enk Zesummenhang ze quantifizéieren awer verschidde Pathogenen, speziell Design, Optimisatioun a Verifizéierungsnormen erfuerderlech sinn.
D'Schmelzkurve ass eng Standardmethod fir d'Spezifizitéit vun Amplikonen ze bewäerten, op d'mannst wat d'Verstäerkung vun engem eenzegen Zil ugeet.Wéi och ëmmer, et muss betount ginn datt d'Schmelzkurven täuschend kënne sinn, well se zum Beispill duerch d'kombinéiert Effekter vun suboptimalen Primer a gerénge Schablounkonzentratioune beaflosst kënne ginn.
P5 |D'Schmelzkurve weist d'Tm Verschiebungen, déi aus zwou Detektioune vu verschiddene Quantitéiten vun zwee Zil-DNAs kritt goufen.
A. Bei méi héije Konzentratioune (ad)) gëtt et keng offensichtlech Primer Dimer nodeems d'qPCR Messung ofgeschloss ass.Wéi d'Schablounkonzentratioun op 50 Exemplare (e) erofgeet, fänkt en net spezifescht Produkt un a gëtt dat eenzegt Produkt mat der niddregster Konzentratioun (f).
B. D'Test opgeholl déi selwecht Tms bei all Zil Konzentratioune, an et war keng offensichtlech primer dimer souguer um niddregsten Konzentratioun (5 Exemplare).Wann Dir dës zwou Detektiounsmethoden benotzt, goufen keng Amplifikatiounsprodukter an NTCs festgestallt.
P5 weist d'Opléisungskurven, déi mat Proben kritt goufen, an deenen d'Schabloun a verschiddene Konzentratioune präsent ass.P 5a weist, datt bei den zwee niddregsten Konzentratioune, der Tms vun der net spezifesch amplification Produite produzéiert manner wéi déi vun der spezifesch amplicons.
Natierlech kann dës Detektiounsmethod net zouverlässeg benotzt ginn fir Ziler z'entdecken déi an niddrege Konzentratioune existéieren.
Interessanterweis hunn NTCs, dh Proben ouni DNA iwwerhaapt, net (net spezifesch) Amplifikatiounsprodukter opgeholl, wat beweist datt den Hannergrondgenomesch DNA un net spezifescher Amplifikatioun / Polymeriséierung deelhuelen kann.
Heiansdo kann esou Hannergrond primers an Net-spezifesch amplification net remedied ginn, mä et ass oft méiglech eng Detektioun Method ze Design déi net Net-spezifesch amplification an all Schabloun Konzentratioun an NTC huet (P 5b).
Hei, och d'Verstäerkung vun der Zilkonzentratioun opzehuelen mat engem Cq vun 35 wäert eng spezifesch Opléisungskurve produzéieren.Ähnlech hunn NTCs keng Unzeeche vun net spezifescher Amplifikatioun gewisen.Heiansdo kann d'Erkennungsverhalen vun der Mammesprooch ofhängeg sinn, an nëmmen net-spezifesch Amplifikatioun gëtt a bestëmmte Pufferkompositioune festgestallt, wat mat verschiddene Mg2+ Konzentratioune verbonne sinn.
Stabilitéit vun Detektioun
D'Optimiséierung vun Ta ass e nëtzleche Schrëtt am empiresche Verifizéierungs- an Optimiséierungsprozess vun der qPCR Detektioun.Et gëtt eng direkt Indikatioun vun der Robustheet vum Primer-Set andeems d'Temperatur (oder Temperaturberäich) weist, déi den niddregsten Cq produzéiert ouni den NTC ze verstäerken.
Den zwee bis véierfach Ënnerscheed an der Sensibilitéit ass vläicht net wichteg fir Leit mat héijen mRNA Ausdrock, awer fir diagnostesch Tester kann et den Ënnerscheed tëscht positiven a falschen negativen Resultater bedeiten.
D'Ta Eegeschafte vu qPCR Primer kënne staark variéieren.E puer Tester sinn net ganz robust, a wa se net ënner dem optimalen Ta-Wäert vun de Primer gemaach ginn, wäerte se séier zesummeklappen.
Dëst ass wichteg well dës Zort vun Detektioun dacks problematesch an der realer Welt ass, an d'Rengheet vun der Probe, d'Konzentratioun vun der DNA oder d'Präsenz vun aneren DNA ass vläicht net optimal.
Zousätzlech kann d'Zilkopienummer an enger breeder Palette variéieren, an d'Reagenser, Plastiksgeschir oder Instrumenter kënnen ënnerschiddlech sinn wéi déi, déi beim Opbau vum Test benotzt ginn.
P6|Den Temperaturgradient weist déi ënnerschiddlech Robustheet vun der PCR Detektioun.
A. Benotzt Bioline's Sensifast SYBR Mastermix (Katalognummer BIO-98050) fir PCR op cDNA aus dem mënschleche Gehir RNA auszeféieren.
B. Benotzt Bio-Rad d'CFX qPCR Instrument der amplification Kaart an Opléisung Kéier vun apalene zu Rekord (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Amplifikatioun Grafik a Schmelzkurve vun ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Amplifikatioun Grafik an Opléisung Curve vun GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs op verschiddene annealing Temperaturen opgeholl, weist den Ënnerscheed am Cq ënner engem 7C Temperaturgradient opgeholl.
P 6 weist en typesche Resultat vun engem ongewollten Test, wou qPCR mat engem Gradient Tas tëscht 59C an 67C (P 6a) gesuergt gouf, mat Primer fir dräi mënschlech Gehirspezifesch Genen.
Et kann aus der Amplifikatiounsgrafik gesi ginn datt Opalin Primer wäit vun ideal sinn, well hir optimal Ta-Gamme ganz schmuel ass (Dorënner 6b), dat heescht, Cqs si wäit verspreet, wat dozou gefouert huet datt Cqs wesentlech mat hiren optimalen Cqs Low verglach ginn.
Dës Detektiounsmethod ass onbestänneg a kann zu suboptimaler Amplifikatioun féieren.Dofir sollt dëst Pair vu Primer nei designt ginn.Zousätzlech weist d'Schmelzkurve Analyse (Inset) datt d'Spezifizitéit vun dëser Detektiounsmethod och problematesch ka sinn, well d'Schmelzkurve vun all Ta anescht ass.
D'ACSBG1 Detektiounsmethod, déi am P 6c gewise gëtt, ass méi robust wéi d'Opalin Detektiounsmethod hei uewen, awer et ass nach ëmmer wäit vun ideal, an et ass méiglech datt et verbessert ka ginn.
Wéi och ëmmer, betoune mir datt et keng noutwendeg Verbindung tëscht Robustheet a Spezifizitéit ass, well d'Opléisungskurve, déi vun dëser Detektiounsmethod produzéiert gëtt, deeselwechte Spëtzewäert an all Tas (Inset) weist.
Op der anerer Säit ass de Robustheetstest vill méi tolerant, a produzéiert ähnlech Cqs an enger breeder Palette vun Tas, wéi am GFAP Test am P 6d gewisen.
Den Ënnerscheed zu Cqs, déi am selwechte 8 Grad Celsius Gamme kritt gëtt, ass manner wéi 1, an d'Opléisungskurve (Inset) bestätegt d'Erkennungseigenschaften an dësem Temperaturberäich.Et ass derwäert ze bemierken datt déi berechent Tas an déi aktuell Ta Range ganz ënnerschiddlech kënne sinn.
Et gi vill Richtlinnen entwéckelt fir Fuerscher ze hëllefen effizient Primer ze designen, déi meescht vun deenen op laang etabléiert Regelen baséieren a vill Opmierksamkeet op den 3'Enn vun de Primer bezuelt ginn.Et gëtt dacks recommandéiert e G oder C um 3' Enn an zwee G oder C Basen (GC Clamp) ze enthalen, awer net méi wéi zwee vun de leschte 5 Basen.
An der Praxis kënnen dës Regele Fuerscher guidéieren, awer si sinn net onbedéngt ënner all Ëmstänn korrekt.
P7 |Den 3'Enn vum Primer huet wéineg Effekt op Spezifizitéit oder Effizienz.
A. D'Positioun vun de Primer fir de Mënsch HIF-1α (NM_181054.2) Gen.
B. Benotzt Agilent Brilliant III SYBR Gréng Mamm Likör (Cat. Nr. 600882) fir eng verstäerkt sechs Test Elementer.
C. Amplifikatioun Grafik a Schmelzkurve opgeholl vum Bio-Rad's CFX qPCR Instrument an 3'Enn Primer.NTCs ginn a rout gewisen.
D. Cqs Rekord vun all Test Element
Zum Beispill, d'Resultat am P 7 widdersprécht der 3'end Regel.All Designs produzéieren am Fong déiselwecht Resultater, mat nëmmen zwee Primer Kombinatiounen déi zu net spezifescher Amplifikatioun am NTC féieren.
Wéi och ëmmer, mir kënnen den Effekt vum GC Clip net ënnerstëtzen, well an dësem Fall benotzt A oder T als maximal 30 Basen keng Spezifizitéit reduzéieren.
Test C, wou de F Primer op GGCC endet, huet Cqs an NTCs opgeholl, wat beweist datt een dës Sequenzen um 30-Enn vermeide wëllt.Mir betounen datt deen eenzege Wee fir déi bescht 3'End Sequenz vun engem Primerpaar ze bestëmmen ass e puer Kandidatprimer experimentell ze evaluéieren.
Amplifikatioun Effizienz
Wichteg ass, obwuel net spezifesch PCR Detektioun ni spezifesch ka ginn, kann d'Verstäerkungseffizienz op vill verschidde Weeër ugepasst a maximéiert ginn andeems d'Enzym, d'Mutter Likör, d'Additive an d'Vëlosbedéngungen geännert ginn.
Fir d'Effizienz vun der PCR Detektioun ze evaluéieren, ass et am beschten eng Serienverdünnung vun 10 oder 5 Mol d'Zilnukleinsäure ze benotzen, dat heescht d'"Standard Curve Method".
Wann PCR Ampliconen oder syntheteschen DNA Ziler benotzt gi fir eng Standardkurve ze generéieren, sollten serial Verdünnungen vun dësen Ziler mat enger konstanter Quantitéit un Hannergrond DNA (wéi genomesch DNA) gemëscht ginn.
P8 |Verdünnungskurve fir d'Effizienz vum PCR ze evaluéieren.
A. Benotzt primers fir HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA an R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC an Agilent's Brilliant III SYBR Green Mastermix (Katalognummer 600882) fir PCR a Schmelzkurvebedéngungen.
B. 100 ng RNS war ëmgedréint transcribed, verdënntem 2 Mol, a Serien verdënntem cDNA Echantillon waren 5 Mol zu 1 ng mënschlech genomic DNA verdënntem.D'Schmelzkurve gëtt am Inset gewisen.
C. D'RT Reaktioun, Verdünnung, a Serien Verdünnung goufen fir déi zweet cDNA Probe widderholl, an d'Resultater waren ähnlech.
P 8 weist zwou Standardkurven, mat der selwechter Detektiounsmethod op zwou verschiddene cDNA-Proben, d'Resultat ass déiselwecht Effizienz, ongeféier 100%, an de R2-Wäert ass och ähnlech, dat heescht de Fitgrad tëscht den experimentellen Daten an der Regressiounslinn oder d'Daten Grad vun der Linearitéit.
Déi zwee Standardkurven si vergläichbar, awer net genau d'selwecht.Wann den Zweck ass d'Zil präzis ze quantifizéieren, muss et bemierkt ginn datt et inakzeptabel ass eng Kopie Zuel Berechnung ze bidden ouni d'Onsécherheet z'erklären
P9 |Miessongsécherheet verbonne mat der Quantifizéierung mat enger Standardkurve.
A. Benotzt Primer fir GAPDH (NM_002046) fir PCR a Schmelzkurvebedéngungen auszeféieren.F: ACAGTTGCCATGTAGACC a R: TAACTGGTTGAGCACAGG a Bioline's Sensifast SYBR Mastermix (Katalognummer BIO-98050).
B. Amplification Chart, Schmelzkurve a Standardkurve opgeholl mat Bio-Rad's CFX qPCR Instrument.
C. Standard Curve Grafik an 95% Vertrauensintervall (CI).
D. D'Kopie Zuel an 95% Vertrauensintervall vun den dräi Cq Wäerter ofgeleet vun der Verdünnungskurve.
P 9 weist datt fir en optimiséiertem Test déi inherent Variabilitéit vun enger eenzeger Standardkurve ongeféier 2 Mol ass (95% Vertrauensintervall, Minimum bis Maximum), wat déi klengst Variabilitéit ass déi erwaart ka ginn.
Zesummenhang Produkt:
Post Zäit: Sep-30-2021
