RT-qPCR gëtt aus der gewéinlecher PCR Technologie entwéckelt.Et füügt fluoreszent Chemikalien (fluoreszent Faarfstoffer oder fluoreszent Sonden) un den traditionelle PCR-Reaktiounssystem, an detektéiert de PCR-annealing- an Extensiounsprozess an Echtzäit no hire verschiddene lumineszent Mechanismen.Fluoreszent Signal Ännerungen am Medium gi benotzt fir de Betrag vun der Produktännerung an all Zyklus vu PCR ze berechnen.De Moment sinn déi heefegst Methoden d'fluoreszent Faarfmethod a Sondemethod.

Fluorescent Dye Method:
E puer fluoreszent Faarfstoffer, wéi SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., emittéieren net eleng Liicht, awer emittéieren Fluoreszenz no der Bindung un déi kleng Groove vum dsDNA.Dofir, am Ufank vun der PCR Reaktioun, kann d'Maschinn net de fluoreszent Signal erkennen.Wann d'Reaktioun op d'Annealing-Verlängerung (Zwee-Schrëtt Method) oder d'Verlängerungsstadium (Dräi-Schrëtt Method) weidergeet, ginn déi Duebelstrécke zu dëser Zäit opgemaach, an déi nei DNA Polymerase Wärend der Strangsynthese ginn fluoreszent Moleküle an der dsDNA Minor Groove kombinéiert a emittéieren Fluoreszenz.Wéi d'Zuel vun de PCR-Zyklen eropgeet, kombinéiere méi a méi Faarfstoffer mat dsDNA, an de fluoreszent Signal gëtt och kontinuéierlech verbessert.Huelt SYBR Green Ⅰ als Beispill.
Probe Method:
Taqman Sonde ass déi meescht benotzt Hydrolyse Sonde.Et gëtt eng fluoreszent Grupp um 5′ Enn vun der Sonde, normalerweis FAM.D'Sond selwer ass eng Sequenz komplementar zum Zilgen.Et gëtt eng fluoreszent Quenching Grupp um 3′ Enn vun der Fluorophore.No dem Prinzip vun der Fluoreszenz Resonanz Energie Transfert (Förster Resonanz Energie Transfert, FRET), wann d'Reporter fluorescent Grupp (Spender fluorescent Molekül) an der quenching fluorescent Grupp (Acceptor fluorescent Molekül) Wann d'Excitatioun Spektrum iwwerlappt an d'Distanz ass ganz no (7-10 Molekülle vun der fluorescerende Can), den Akzeptormolekül, während d'Autofluoreszenz geschwächt ass.Dofir, am Ufank vun der PCR Reaktioun, wann d'Sond fräi an intakt am System ass, wäert d'Reporter fluoreszent Grupp keng Fluoreszenz emittéieren.Beim annealing binden de Primer an d'Sonde un d'Schabloun.Wärend der Verlängerungsstadium synthetiséiert d'Polymerase kontinuéierlech nei Ketten.DNA Polymerase huet 5′-3′ Exonuklease Aktivitéit.Wann d'Sonde erreecht gëtt, wäert d'DNA-Polymerase d'Sond aus der Schabloun hydrolyséieren, d'Reporter-Fluoreszent-Grupp vun der Quencher-Fluoreszent-Grupp trennen an de fluoreszent Signal fräiginn.Well et eng een-zu-een Relatioun tëscht der Sonde an der Schabloun ass, ass d'Sondemethod superieur wéi d'Faarfmethod wat d'Genauegkeet an d'Sensibilitéit vum Test ugeet.

Lalumi 1 Prinzip vun qRT-PCR

Primer Design
Prinzipien:

D'Primer sollen an der konservéierter Regioun vun der Nukleinsäure-Serie entworf ginn an Spezifizitéit hunn.

Et ass am beschten cDNA Sequenz ze benotzen, an mRNA Sequenz ass och akzeptabel.Wann net, entdeckt d'CDs Regioun Design vun der DNA Sequenz.
D'Längt vum fluoreszent quantitativen Produkt ass 80-150bp, de längsten ass 300bp, d'Primerlängt ass allgemeng tëscht 17-25 Basen, an den Ënnerscheed tëscht den Upstream an Downstream Primer sollt net ze grouss sinn.

De G+C Inhalt ass tëscht 40% an 60%, a 45-55% ass am Beschten.
Den TM Wäert läit tëscht 58-62 Grad.
Probéiert Primer Dimeren a Selbstdimeren ze vermeiden, (schéngen net méi wéi 4 Pairen vun konsekutiv komplementäre Basen) Haarnadelstruktur, wann onvermeidlech, maacht ΔG <4.5kJ/mol* Wann Dir net suerge kënnt datt gDNA wärend der ëmgedréint Transkriptioun geläscht gouf Clean, et ass am beschten d'Primeren vun der Intron z'evitéieren an G′C evitéiert ze vermeiden, /C, A/G kontinuéierlech Struktur (2-3) Primer an net-
spezifesch D'Homologie vun der heterogen amplifizéierter Sequenz ass léiwer manner wéi 70% oder huet 8 komplementär Basis Homologie.
Datebank:
CottonFGD Sich no Schlësselwieder
Primer Design:
IDT-qPCR Primer Design

Fig2 IDT Online Primer Design Tool Säit

Fig 3 Resultat Säit Display
Design vun lncRNA Primer:
lncRNA:déiselwecht Schrëtt wéi mRNA.
miRNA:De Prinzip vun der Stamm-Loop-Methode: Well all miRNAs kuerz Sequenzen vun ongeféier 23 nt sinn, kann direkt PCR-Detektioun net gemaach ginn, sou datt de Stamm-Loop-Sequenz-Tool benotzt gëtt.D'Stamm-Loop Sequenz ass eng eenzegstrengeg DNA vu ronn 50 nt, déi selwer eng Haarnadelstruktur bilden kann.3 'D'Enn kann als Sequenz komplementär zum miRNA partielle Fragment entworf ginn, da kann d'ZilmiRNA mat der Stamm-Loop Sequenz wärend der ëmgedréint Transkriptioun verbonne sinn, an d'Gesamtlängt kann 70bp erreechen, wat entsprécht der Längt vum amplifizéierte Produkt bestëmmt duerch qPCR.Tailing miRNA Primer Design.
Amplifikatioun spezifesch Detektioun:
Online Blast Datebank: CottonFGD Blast duerch Sequenz Ähnlechkeet
Lokal Blast: Referéiert op d'Benotzung vu Blast + fir lokal Blast ze maachen, Linux a Macos kënnen direkt eng lokal Datebank etabléieren, win10 System kann och gemaach ginn nodeems Dir Ubuntu Bash installéiert.Erstellt lokal Blast Datebank a lokal Blast;oppen Ubuntu bash op win10.
Bemierkung: Upland Koteng a Mier Insel Koteng sinn tetraploid Kulturen, sou datt d'Resultat vum Héichuewen dacks zwee oder méi Matcher sinn.An der Vergaangenheet, benotzt NAU CDs als Datebank fir Explosioun auszeféieren ass méiglecherweis zwee homolog Genen mat nëmmen e puer SNP Differenzen ze fannen.Normalerweis kënnen déi zwee homolog Genen net duerch Primer Design getrennt ginn, sou datt se als d'selwecht behandelt ginn.Wann et en offensichtlechen Indel gëtt, gëtt de Primer normalerweis op der Indel entwéckelt, awer dëst kann zu der sekundärer Struktur vum Primer féieren.

Detektioun vun der Primer sekundär Struktur:
Schrëtt:oppen Oligo 7 → Input Schabloun Sequenz → Zoumaache Ënner-Fënster → späicheren → primer op Schabloun lokaliséieren, dréckt ctrl + D fir d'Primerlängt ze setzen → analyséiert verschidde sekundär Strukturen, wéi Selbstdimeriséierungskierper, Heterodimer, Haarnadel, Mismatch, etc. Déi lescht zwou Biller an der Figur 4 sinn d'Testresultater vun de Primer.D'Resultat vun der viischter Primer ass gutt, et gëtt keng offensichtlech Dimer a Haarnadelstruktur, keng kontinuéierlech komplementär Basen, an den absolute Wäert vun der fräier Energie ass manner wéi 4,5, während de Réckprimer kontinuéierlech weist.Zousätzlech, eng méi sérieux dimer schéngt um 3 'Enn, an engem dimer vun 4 pafolgende Basen schéngt.Obwuel d'fräi Energie net héich ass, kann den 3'-Dimer Chl d'Verstäerkungsspezifizitéit an d'Verstäerkungseffizienz eescht beaflossen.Zousätzlech ass et néideg fir Haarnadelen, Heterodimeren a Mëssverständiser ze kontrolléieren.

Fig3 oligo7 erkennen Resultater
Amplifikatioun Effizienz Detektioun:
D'Verstäerkungseffizienz vun der PCR Reaktioun beaflosst eescht d'PCR Resultater.Och am qRT-PCR ass d'Verstäerkungseffizienz besonnesch wichteg fir déi quantitativ Resultater.Ewechzehuelen aner Substanzen, Maschinnen a Protokoller am Reaktioun Puffer.D'Qualitéit vun de primers huet och e groussen Afloss op der amplification Effizienz vun qRT-PCR.Fir d'Genauegkeet vun de Resultater ze garantéieren, muss souwuel déi relativ Fluoreszenzquantifikatioun an déi absolut Fluoreszenzquantifikatioun d'Verstäerkungseffizienz vun de Primer z'entdecken.Et gëtt unerkannt datt déi effektiv qRT-PCR Amplifikatiounseffizienz tëscht 85% an 115% ass.Et ginn zwou Methoden:
1. Standard Curve Method:
a.Mix cDNA
b.Gradient Verdünnung
c.qPCR
d.Linear Regressioungleichung fir d'Verstäerkungseffizienz ze berechnen
2. LinRegPCR
LinRegPCR ass e Programm fir d'Analyse vun Echtzäit RT-PCR Daten, och genannt quantitative PCR (qPCR) Daten baséiert op SYBR Green oder ähnlech Chimie.De Programm benotzt net-baseline korrigéiert Donnéeën, mécht eng Baseline Korrektur op all Prouf getrennt, bestëmmt eng Fënster-vun-Linearitéit a benotzt dann linear Regressioun Analyse fir eng riicht Linn duerch d'PCR Dateset ze passen.Aus dem Hang vun dëser Linn gëtt d'PCR-Effizienz vun all eenzel Prouf berechent.Déi duerchschnëttlech PCR Effizienz pro Amplikon an den Ct Wäert pro Probe gi benotzt fir eng Startkonzentratioun pro Probe ze berechnen, ausgedréckt an arbiträr Fluoreszenzeenheeten.Donnéeën Input an Output sinn duerch eng Excel Spreadsheet.Nëmmen Prouf
Vermëschung ass erfuerderlech, kee Gradient
Schrëtt sinn néideg:(Huelt de Bole CFX96 als Beispill, net ganz Maschinn mat kloren ABI)
Experiment:et ass e Standard qPCR Experiment.
qPCR Datenausgang:LinRegPCR kann zwou Forme vun Ausgangsdateien erkennen: RDML oder Quantifikatioun Amplifikatioun Resultat.Tatsächlech ass et den Echtzäitdetektiounswäert vun der Zyklusnummer an dem Fluoreszenzsignal vun der Maschinn, an d'Verstäerkung gëtt kritt andeems de Fluoreszenzännerungswäert vun der linearer Segmenteffizienz analyséiert gëtt.
Donnéeën Auswiel: An der Theorie soll den RDML Wäert benotzbar sinn.Et gëtt geschat datt de Problem vu mengem Computer ass datt d'Software RDML net erkennt, also hunn ech den Excel-Ausgangswäert als Originaldaten.Et ass recommandéiert fir d'éischt e graff Duerchmusterung vun den Donnéeën auszeféieren, wéi zum Beispill den Echec vu Proben ze addéieren, etc. D'Punkte kënnen an den Ausgabdaten geläscht ginn (natierlech kënnt Dir se net läschen, LinRegPCR ignoréiert dës Punkten an der spéider Stuf)

Fig 5 qPCR Datenexport

Fig6 Auswiel vun Kandidat Echantillon

Dateninput:Open Qualifikatioun Verstäerkung results.xls, → oppen LinRegPCR → Datei → aus Excel liesen → wielt Parameteren wéi an der Figur 7 → OK → klickt bestëmmen baselines

Fig7 Schrëtt vun linRegPCR Daten Input

Resultat:Wann et keng Widderhuelung gëtt, ass keng Gruppéierung erfuerderlech.Wann et Widderhuelung gëtt, kann d'Gruppéierung an der Probegruppéierung geännert ginn, an den Numm vum Gen gëtt an den Identifizéierer aginn, an da gëtt dee selwechte Gen automatesch gruppéiert.Endlech, klickt op d'Datei, exportéiert Excel, a kuckt d'Resultater.D'Verstäerkungseffizienz an d'R2 Resultater vun all Brunn ginn ugewisen.Zweetens, wann Dir a Gruppen opdeelt, gëtt déi korrigéiert duerchschnëttlech Verstäerkungseffizienz ugewisen.Vergewëssert Iech datt d'Verstäerkungseffizienz vun all Primer tëscht 85% an 115% ass.Wann et ze grouss oder ze kleng ass, heescht et datt d'Verstäerkungseffizienz vum Primer schlecht ass.

Fig 8 Resultat an Datenausgang

Experimentell Prozess:
RNA Qualitéit Ufuerderunge:
Puritéit:1.72.0 beweist datt et Rescht Isothiocyanat ka sinn.Propper Nukleinsäure A260 / A230 soll ongeféier 2 sinn. Wann et eng staark Absorptioun bei 230 nm gëtt, weist et datt et organesch Verbindunge wéi Phenateionen sinn.Zousätzlech kann et duerch 1,5% Agarosegel Elektrophorese festgestallt ginn.Point de Marker, well d'ssRNA keng Denaturatioun huet an de Molekulargewiichtlogarithmus keng linear Bezéiung huet, an d'Molekülgewiicht kann net korrekt ausgedréckt ginn.Konzentratioun: Theoreteschnetmanner wéi 100ng / ul, wann d'Konzentratioun ze niddreg ass, ass d'Rengheet allgemeng niddereg net héich

Fig 9 RNA gel

Zousätzlech, wann d'Probe wäertvoll ass an d'RNA Konzentratioun héich ass, ass et recommandéiert et no der Extraktioun ze aliquotéieren an d'RNA op eng final Konzentratioun vun 100-300ng / ul fir ëmgedréint Transkriptioun ze verdënnen.Ande Prozess vun der ëmgedréint Transkriptioun, wann mRNA transkriptéiert ass, Oligo (dt) primers datt speziell zu polyA Schwänz bindelen fir ëmgedréint Transkriptioun benotzt ginn, iwwerdeems lncRNA an circRNA benotzen zoufälleg hexamer (Zoufälleg 6 mer) primers fir ëmgedréint Transkriptiouns vun total RNA Fir miRNA, miRNA-spezifesch Hals-Loop reverse primers benotzt ginn.Vill Firmen hunn elo speziell Schwanzkits lancéiert.Fir d'Stamm-Loop-Method ass d'Tailing-Methode méi praktesch, héich-Duerchschnëtt a reagensspuerend, awer den Effekt vun z'ënnerscheeden miRNAs vun der selwechter Famill sollt net sou gutt sinn wéi d'Stamm-Loop-Methode.All ëmgedréint Transkriptiounskit huet Ufuerderunge fir d'Konzentratioun vu genspezifesche Primer (Stammschleifen).Déi intern Referenz fir miRNA benotzt ass U6.Am Prozess vun der Stamm-Loop-Inversioun sollt e Rouer vun U6 getrennt ëmgedréit ginn, an d'Front- a Réckprimer vun U6 sollen direkt bäigefüügt ginn.Béid circRNA an lncRNA kënnen HKGs als intern Referenz benotzen.AncDNA Detektioun,
wann et kee Problem mat RNA ass, cDNA soll och gutt sinn.Wéi och ëmmer, wann d'Perfektioun vum Experiment verfollegt gëtt, ass et am beschten en internt Referenzgen (Referenzgen, RG) ze benotzen deen gDNA vun CDen z'ënnerscheeden kann.Allgemeng ass RG en Haushaltsgen., HKG) wéi an der Figur 10;Zu där Zäit hunn ech Sojabohnspäicherprotein gemaach an hunn Actin7 mat Intronen als intern Referenz benotzt.D'Gréisst vum amplifizéierte Fragment vun dësem Primer am gDNA war 452bp, a wann cDNA als Schabloun benotzt gouf, war et 142bp.Dunn hunn d'Testresultater festgestallt datt en Deel vun der cDNA tatsächlech duerch gDNA kontaminéiert gouf, an et huet och bewisen datt et kee Problem mam Resultat vun der ëmgedréint Transkriptioun war, an et kéint als Schabloun fir PCR benotzt ginn.Et ass nëtzlos fir Agarosegel Elektrophorese direkt mat cDNA auszeféieren, an et ass eng diffus Band, déi net iwwerzeegend ass.

Fig 10 cDNA Detektioun

D'Determinatioun vun qPCR Konditiounenass allgemeng kee Problem laut dem Protokoll vum Kit, haaptsächlech am Schrëtt vun tm Wäert.Wann e puer primers während primer Design net gutt entworf sinn, doraus zu engem groussen Ënnerscheed tëscht dem tm Wäert an der theoretescher 60 ° C, ass et recommandéiert, datt d'cDNA No der Echantillon gemëscht ginn, lafen e Gradient PCR mat primers, a probéiert d'Temperatur ouni Bands wéi den TM Wäert ze vermeiden.

Donnéeën Analyse

Déi konventionell relativ Fluoreszenz quantitativ PCR Veraarbechtungsmethod ass am Fong no 2-ΔΔCT.Donnéeën Veraarbechtung Schabloun.

Zesummenhang Produkter:

Echtzäit PCR Einfach^TM -Taqman

Echtzäit PCR Einfach^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix fir éischt Strang cDNA Synthese)

RT Easy II (Master Premix fir éischt Strang cDNA Synthese fir qPCR)