• facebook
  • linkedin
  • youtube

neie1

. Erhéicht d'Sensibilitéit vum Reaktiounssystem:

1. Separat héichqualitativ RNA:

Erfollegräich cDNA Synthese kënnt aus héichqualitativ RNA.Héichqualitativ RNA soll op d'mannst eng total méi laang garantéieren an enthält keng Inhibitoren déi keng Enzyme enthalen, wéi EDTA oder SDS.D'Qualitéit vum RNA bestëmmt de maximale Wäert vun der Sequenzinformatioun déi Dir op d'cDNA transkriptéiere kënnt.Déi allgemeng RNA Reinigungsmethod ass eng Schrëttmethod fir Isoocyanat / Acidophenol ze benotzen.Fir d'Verschmotzung vun RNase ze vermeiden, erfuerdert d'RNA, getrennt vun enger Probe reich an RNase (wéi Bauchspaicheldrüs) Späichere vu Formaldehyd fir qualitativ héichwäerteg RNA ze spueren, wat nach méi fir laangfristeg Lagerung ass.D'RNA, déi aus der Rattenleber extrahéiert gouf, gouf am Fong no enger Woch vun der Lagerung am Waasser ofgebaut, während d'RNA, déi aus der Rattenmilz extrahéiert gouf, stabil bliwwen ass no dräi Joer Lagerung am Waasser.Zousätzlech si Transkripte méi grouss wéi 4kb méi empfindlech fir d'RNase-Degradatioun ze spueren wéi kleng Transkriptiounen.Fir d'Stabilitéit vun der Späicher-RNA-Probe ze erhéijen, kann d'RNA an engem Methalmamin vun Ion opgeléist ginn a gëtt -70 °C gespäichert.Thylide benotzt fir RNA ze späicheren däerf keen verschiddenen Objet enthalen deen RNA degradéiert.RNA, dat aus der Bauchspaicheldrüs ofgeleet ass, kann op d'mannst ee Joer am Methalmamin gespäichert ginn.Wann Dir bereet sidd RNA ze benotzen, kënnt Dir déi folgend Methoden benotzen fir RNA auszeschléissen: NaCl op 0,2m a 4 Mol de Volume vun Ethanol addéieren, Raumtemperatur fir 3-5 Minutten setzen, an 10.000 × g Zentrifugal fir 5 Minutten.

2. Benotzt ëmgedréint Transkriptase ouni RNaseH Aktivitéit (RNaseH-):

RNase Inhibitoren ginn dacks bäigefüügt fir ëmgedréint Transkriptiounsreaktiounen fir d'Längt an d'Ausbezuelung vun der cDNA Synthese ze erhéijen.RNase Inhibitor gëtt an der éischter Kettensynthese Reaktioun a Präsenz vu Puffer a Reduzéierungsmëttelen wéi DTT bäigefüügt, well de Pre-cDNA Syntheseprozess den Inhibitor denaturéiert, an doduerch gebonnen RNase fräigelooss, déi RNA degradéieren.Protein RNase Inhibitor verhënnert nëmmen d'Degradatioun vun RNA duerch RNase A, B, C, a verhënnert net RNases op der Haut, sou datt Dir sollt oppassen fir net RNases aus de Fangeren trotz der Benotzung vun dësen Inhibitoren aféieren.

Reverse Transkriptase katalyséiert d'Konversioun vu RNA an cDNA.Béid M-MLV an AMV hunn endogen RNaseH Aktivitéit zousätzlech zu hirer eegener Polymerase Aktivitéit.RNaseH Aktivitéit konkurréiert mat der Polymerase Aktivitéit fir heterozygot Strécke geformt tëscht RNA Templates an DNA Primer oder cDNA Extensioun Strécke, a degradéiert RNA: RNA Strécke an DNA Komplexe.RNA Templates degradéiert duerch RNaseH Aktivitéit kënnen net méi als effektiv Substrate fir cDNA Synthese benotzt ginn, wat d'Ausbezuelung an d'Längt vun der cDNA Synthese reduzéiert.Also eliminéiert oder staark reduzéiert d'RNaseH Aktivitéit vun der ëmgedréint Transkriptase wier vu grousse Virdeel.

SuperScriptⅡ ëmgedréint Transkriptase, MMLV ëmgedréint Transkriptase vun RNaseH- an ThermoScript ëmgedréint Transkriptase, AMV vun RNaseH- huet méi cDNA vu voller Längt wéi MMLV an AMV.RT-PCR Empfindlechkeet ass beaflosst vun der Quantitéit vun synthetiséiert cDNA.ThermoScript ass vill méi sensibel wéi AMV.D'Gréisst vun RT-PCR Produkter ass limitéiert duerch d'Fäegkeet vu Reverse Transkriptase fir cDNA ze synthetiséieren, besonnesch wann Dir méi grouss Cdnas klonet.Am Verglach mam MMLV huet SuperScripⅡ d'Ausbezuele vu laange RT-PCR Produkter wesentlech erhéicht.RNaseH-'s ëmgedréint Transkriptase erhéicht och d'thermesch Stabilitéit, sou datt d'Reaktioun bei Temperaturen méi héich wéi normal vun 37-42 ℃ duerchgefouert ka ginn.Ënnert der proposéiert Synthes Konditiounen, oligo (dT) primers an 10μCi [alpha-p] dCTP sech benotzt.D'Gesamtproduktioun vun der éischter Kette gouf mat der TCA Nidderschlagsmethod berechent.Volllängt cDNA gouf analyséiert mat der Gréisst-sortéierter Sträifentfernung a zielt an engem alkalesche Agarosegel.

3. Erhéije d'Wärmekonservatiounstemperatur vun der ëmgedréint Transkriptioun:

Méi héich Halttemperatur hëlleft fir déi sekundär Struktur vun der RNA opzemaachen an d'Ausbezuele vun der Reaktioun ze erhéijen.Fir déi meescht RNA Templates, d'RNA an de Primer bei 65 ° C ouni Puffer oder Salz ze halen an se dann séier op Äis ze killen eliminéiert déi meescht sekundär Strukturen an erlaabt d'Primeren ze binden.Wéi och ëmmer, e puer Templates hunn nach ëmmer sekundär Struktur, och no thermescher Denaturatioun.Amplifikatioun vun dëse schwieregen Templates ka mat ThermoScript ëmgedréint Transkriptase ausgeführt ginn an duerch d'Plaze vun der ëmgedréint Transkriptase Reaktioun bei méi héijen Temperaturen fir d'Verstäerkung ze verbesseren.Méi héich Halttemperaturen kënnen och Spezifizitéit erhéijen, besonnesch wann d'cDNA Synthese mat genspezifesche Primer (GSPS) duerchgefouert gëtt (kuckt Kapitel 3).Wann Dir GSP benotzt, gitt sécher datt den Tm Wäert vum Primer d'selwecht ass wéi déi erwaart Halttemperatur.Benotzt net Oligo (dT) an zoufälleg Primer iwwer 60 ℃.Zoufälleg Primer musse bei 25 ℃ fir 10 Minutte gehal ginn ier se op 60 ℃ eropgeet.Zousätzlech fir méi héich ëmgedréint Transkriptiounstemperaturen ze benotzen, kann d'Spezifizitéit verbessert ginn andeems d'RNA / Primer Mëschung direkt vun der 65 ℃ denaturéierend Temperatur op d'Reverse Transkriptiounshalttemperatur transferéiert an eng virgehëtzt 2 × Reaktiounsmëschung (cDNA thermesch Initiatiounssynthese) bäidréit.Dës Approche hëlleft d'intermolekulare Basispaarung ze verhënneren, déi bei méi nidderegen Temperaturen geschitt.Mat engem PCR Instrument vereinfacht déi vill Temperaturschalter déi fir RT-PCR néideg sinn.

Tth Hëtztstabiliséierter Polymerase handelt als DNA Polymerase a Präsenz vu Mg2+ a RNA Polymerase a Präsenz vu Mn2+.Et kann Hëtzt op bis zu 65 ℃ halen.Wéi och ëmmer, d'Präsenz vu Mn2+ wärend PCR reduzéiert d'Fidelitéit, wat Tth Polymerase manner gëeegent mécht fir héich Präzisioun Amplifikatioun, sou wéi cDNA Klonen.Zousätzlech ass Tth manner effizient bei der ëmgedréint Transkriptioun, wat d'Sensibilitéit reduzéiert, a well en eenzegen Enzym ëmgedréint Transkriptioun a PCR ka maachen, kënnen d'Kontrollreaktiounen ouni ëmgedréint Transkriptioun net benotzt ginn fir amplifizéiert Produkter vu cDNA vun deenen vun kontaminéierter genomesch DNA z'ënnerscheeden.

4. Additiv dat ëmgedréint Transkriptioun fördert:

D'Zousatz vun Additiven, dorënner Glycerin an DMSO, fir déi éischt Kettensynthese Reaktioun kann d'Stabilitéit vun der Nukleinsäure Duebelstreng reduzéieren an d'RNA sekundär Struktur entspanen.Bis zu 20% Glycerin oder 10% DMSO kënne bäigefüügt ginn ouni d'Aktivitéit vu SuperScriptⅡ oder MMLV ze beaflossen.AMV kann och bis zu 20% Glycerin toleréieren ouni d'Aktivitéit ze reduzéieren.Fir d'Sensibilitéit vum RT-PCR an der SuperScriptⅡ ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun ze maximéieren, kann 10% Glycerin derbäigesat ginn a bei 45 ℃ isoléiert ginn.Wann 1/10 vum Retrotranskriptiounsreaktiounsprodukt zum PCR bäigefüügt gëtt, ass d'Konzentratioun vu Glycerol an der Amplifikatiounsreaktioun 0,4%, wat net genuch ass fir PCR ze hemmen.

5. RNaseH Veraarbechtung:

Sensibilitéit kann verbessert ginn andeems d'cDNA Synthesereaktioune mat RNaseH virum PCR behandelt ginn.Fir e puer Template gëtt et geduecht datt d'RNA an der cDNA Synthesereaktioun d'Bindung vu verstäerkte Produkter verhënnert, an deem Fall d'RNaseH Behandlung d'Sensibilitéit erhéijen.Allgemeng ass d'RNaseH Behandlung erfuerderlech fir d'Verstäerkung vun enger relativ laanger Volllängt cDNA Zilschabloun, sou wéi tuberous ScheroseⅡ mat gerénger Kopie.Fir dës schwiereg Schabloun huet RNaseH d'Signal verbessert, generéiert vun der cDNA synthetiséiert duerch SuperScriptⅡ oder AMV.Fir déi meescht RT-PCR Reaktiounen ass d'RNaseH Behandlung fakultativ well den 95 ℃ isoléierten PCR Denaturatiounsschrëtt typesch d'RNA aus dem RNA: DNA Komplex hydrolyséiert.

6. Verbesserte Methoden fir kleng Quantitéiten un RNA z'entdecken:

RT-PCR ass besonnesch Erausfuerderung wann nëmme kleng Quantitéiten un RNA verfügbar sinn.D'Zousatz vu Glykogen als Träger wärend der RNA Trennung hëlleft d'Ausbezuele vu klenge Proben ze erhéijen.En RNase-gratis Glykogen kann zur selwechter Zäit wéi Trizol bäigefüügt ginn.Glycogen ass Waasserlöslech a kann an der Waasserphase mat RNA bleiwen fir an der spéiderer Nidderschlag ze hëllefen.D'recommandéiert Konzentratioun vu RNase-fräie Glykogen ass 250μg/ml fir Proben manner wéi 50mg Tissue oder 106 kultivéiert Zellen.

D'Zousatz vun acetyléierten BSA fir ëmgedréint Transkriptiounsreaktiounen mat SuperScriptⅡ kann d'Sensibilitéit erhéijen, a fir kleng Quantitéiten un RNA kann d'Quantitéit u SuperScriptⅡ reduzéieren an 40 Eenheeten vum RNAseOut Nuklease-Inhibitor derbäi ginn, den Detektiounsniveau verbesseren.Wann Glykogen an der RNA Trennung benotzt gëtt, ass d'Zousatz vu BSA oder RNase Inhibitoren fir Transkriptiounsreaktiounen ëmgedréint mat SuperScriptⅡ nach ëmmer recommandéiert.

. Erhéijung der Spezifizitéit vun RT-PCR

1. cNDA Synthese:

Dräi verschidde Methode kënne benotzt ginn fir d'éischt Strang cDNA Synthese unzefänken, an d'relativ Spezifizitéit vun all Method beaflosst d'Quantitéit an d'Art vun der synthetiséierter cDNA.

Zoufälleg Primer Method ass déi mannst spezifesch vun den dräi Methoden.Primer ginn op verschidde Siten am ganzen Transkript annealéiert fir kuerz, deelweis Längt cDNA ze produzéieren.Dës Method gëtt dacks benotzt fir 5 'Terminal Sequenzen an cDNA aus RNA Templates mat sekundäre strukturelle Regiounen ze kréien oder mat terminéierende Siten déi ëmgedréint Transkriptase net replizéiere kënnen.Fir de längsten cDNA ze kréien, muss de Verhältnis vu Primer zu RNA an all RNA Probe empiresch bestëmmt ginn.D'initial Konzentratioun vun zoufälleg Primer rangéiert vun 50 bis 250ng pro 20μl Reaktioun System.Well d'cDNA synthetiséiert aus total RNA mat random Primer haaptsächlech ribosomal RNA ass, gëtt Poly(A) + RNA allgemeng als Schabloun ausgewielt.

Oligo (dT) Initiatioun ass méi spezifesch wéi zoufälleg Primer.Et hybridiséiert mam Poly(A) Schwanz, deen um 3′ Enn vu mRNA an de meeschte eukaryoteschen Zellen fonnt gëtt.Well Poly(A) + RNA ongeféier 1% bis 2% vum Gesamt-RNA ass, ass d'Quantitéit an d'Komplexitéit vum cDNA vill manner wéi wann zoufälleg Primer benotzt goufen.Wéinst senger héijer Spezifizitéit erfuerdert Oligo (dT) allgemeng keng Optimiséierung fir RNA zu Primer Verhältnis a Poly (A) + Selektioun.Et ass recommandéiert 0,5μg Oligo (dT) pro 20μl Reaktiounssystem ze benotzen.oligo(dT)12-18 ass gëeegent fir déi meescht RT-PCR.ThermoScript RT-PCR System bitt Oligo(dT)20 wéinst senger gudder thermescher Stabilitéit an ass gëeegent fir méi héich Temperaturen.

Gen-spezifesch Primer (GSP) sinn déi bescht spezifesch Primer fir de Reverse Transkriptiouns Schrëtt.GSP ass en Antisense Oligonukleosid dee spezifesch mat RNA Destinatiounssequenzen hybridize ka, anstatt all Rnas wéi zoufälleg Primer oder Oligo (dT) ze annealéieren.D'Regele benotzt fir PCR Primer ze designen gëllen och fir den Design vun der ëmgedréiter Transkriptiounsreaktioun GSP.GSP kann déiselwecht Sequenz sinn wéi den Amplifikatiounsprimer, deen um Enn vum mRNA3 'annealéiert ass, oder GSP kann entworf ginn fir downstream mat dem ëmgedréint Amplifikatiounsprimer annealéiert ze ginn.Fir e puer amplifizéiert Objeten ass et néideg fir méi wéi een Antisense Primer fir erfollegräich RT-PCR ze designen, well déi sekundär Struktur vun der Zil-RNA kann de Primer verhënnere fir ze binden.Et gëtt ugeholl 1pmol Antisense GSP am éischte Kettensynthese Reaktioun System vun 20μl ze benotzen.

2. Erhéije d'Wärmekonservéierungstemperatur vun der ëmgedréint Transkriptioun:

Fir voll Virdeel vun GSP Spezifizitéit ze huelen, ëmgedréint Transkriptase mat héich thermesch Stabilitéit soll benotzt ginn.Wärmestabil ëmgedréint Transkriptase ka bei méi héijen Temperaturen isoléiert ginn fir d'Reaktiounsstifegkeet ze erhéijen.Zum Beispill, wann e GSP bei 55 ° C annealéiert gëtt, da gëtt d'Spezifizitéit vum GSP net voll genotzt wann ëmgedréint Transkriptioun bei 37 ° C mat gerénger Rigor mat AMV oder M-MLV duerchgefouert gëtt.Wéi och ëmmer, SuperScripⅡ an ThermoScript kënne bei 50 ℃ oder méi reagéieren, wat net spezifesch Produkter eliminéiert, déi bei méi nidderegen Temperaturen produzéiert ginn.Fir maximal Spezifizitéit kann d'RNA / Primer Mëschung direkt vun der 65 ℃ Denaturatiounstemperatur op d'Reverse Transkriptiounshalttemperatur mat der Zousatz vun enger virgehëtzter 2 x Reaktiounsmëschung (thermesch Initiatioun vun der cDNA Synthese) transferéiert ginn.Dëst hëlleft der Basispaarung tëscht Moleküle bei niddregen Temperaturen ze verhënneren.D'Benotzung vun engem PCR Instrument vereinfacht déi vill Temperaturtransitioune fir RT-PCR néideg.

3. Reduzéiert genomesch DNA Kontaminatioun:

Eng potenziell Schwieregkeet mat RT-PCR ass datt RNA genomesch DNA kontaminéiert.D'Benotzung vu bessere RNA Trennungsmethoden, wéi Trizol Reagens, reduzéiert genomesch DNA Kontaminatioun bei RNA Virbereedungen.Fir Produkter aus genomesch DNA ze vermeiden, kann d'RNA mat Amplifikatioun Grad DnasⅠ behandelt ginn fir kontaminéiert DNA virum ëmgedréint Transkriptioun ze läschen.D'Probe goufen bei 65 ℃ an 2.0mM EDTA fir 10 min gehal fir d'DNaseⅠ Verdauung ofzeschléissen.EDTA cheléiert Magnesiumionen fir d'Magnesiumion-ofhängeg RNA-Hydrolyse ze verhënneren, déi bei héijen Temperaturen geschitt.

Fir amplifizéiert cDNA vum Genom DNA Amplifikatiounsprodukt ze trennen, kënnen Primer déi getrennt mam getrennten Exon anneal designt ginn.PCR Produkter ofgeleet vu cDNA wäerte méi kuerz sinn wéi déi aus kontaminéierter genomesch DNA ofgeleet.E kontrolléiert Experiment ouni ëmgedréint Transkriptioun gëtt och op all RNA Template gemaach fir ze bestëmmen ob e bestëmmte Fragment aus genomesch DNA oder cDNA ass.PCR Produkter kritt an der Verontreiung vu ëmgedréint Transkriptioun ginn aus dem Genom ofgeleet.

Zesummenhang Produit

nei2

 

RT-PCR EinfachᵀᴹI (One Step)

-Den One-Step Kit erlaabt ëmgedréint Transkriptioun a PCR am selwechte Rouer auszeféieren.Et brauch nëmmen Template RNA, spezifesch PCR Primer an RNase-Free ddH derbäi ze ginn2O.

- Echtzäit quantitativ Analyse vu RNA ka séier a präzis duerchgefouert ginn.

-De Kit benotzt en eenzegaartege Foregene Reverse Transkriptiounsreagens a Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinéiert mat engem eenzegaartege Reaktiounssystem fir effektiv d'Verstäerkungseffizienz a Spezifizitéit vun der Reaktioun ze verbesseren.

-Den optimiséierte Reaktiounssystem mécht d'Reaktioun méi héich Detektiounsempfindlechkeet, méi staark thermesch Stabilitéit a besser Toleranz.

nei3

 

RT Easy II (Mat GDNase) Master Premix Fir Éischt-Strand CDNA Synthese Fir Echtzäit PCR Mat GDNase

-Effektiv Fäegkeet fir gDNA ze läschen, wat gDNA an der Schabloun bannent 2 Minutten ewechhuelen kann.

-Effektiv ëmgedréint Transkriptiounssystem, et dauert just 15 Minutten fir d'Synthese vum éischte Strang cDNA ofzeschléissen.

-Komplex Templates: Templates mat héijen GC Inhalt a komplexer sekundärer Struktur kënnen och mat héijer Effizienz ëmgedréit ginn.

-High-Sensitivitéit ëmgedréint Transkriptiounssystem, pg-Niveau Template kënnen och héichqualitativ cDNA kréien.

-De Reverse Transkriptiounssystem huet héich thermesch Stabilitéit, déi optimal Reaktiounstemperatur ass 42 ℃, an et huet nach ëmmer gutt ëmgedréint Transkriptiounsleeschtung bei 50 ℃.


Post Zäit: Mar-07-2023