Traditionell ëmgedréint Transkriptasen kënnen net héich Temperaturen toleréieren (déi optimal Temperatur fir MMLV Aktivitéit ass 37-50 ° C, an AMV ass 42-60 ° C).Déi méi komplex viral RNA kann net effektiv ëmgedréint an cDNA bei niddregen Temperaturen ëmgedréit ginn, wat zu Detektiounseffizienz resultéiert D'Reduktioun.Traditionell RT-qPCR erfuerdert allgemeng d'Participatioun vun zwee Schlësselenzymen (Reverse Transkriptase an DNA Polymerase), wat et onméiglech mécht d'Operatioun vum Reaktiounssystem ze vereinfachen an d'Käschte ze reduzéieren.Hei wäerte mir zwee héich-Temperatur-resistent géint ëmgedréint Transkriptasen aféieren, TtH an RevTaq.Dës zwee Enzyme hunn och d'Funktioun vun DNA Polymerase, sou datt se bifunktionell Enzyme genannt ginn.

TtH DNA polymerase

Dir musst iwwer TtH héieren hunn, déi aus der thermophiler Bakterie Thermus thermophilus HB8 ofgeleet ass.An der Präsenz vun divalente Kationen wéi Mg2+, huet et DNA Polymerase Aktivitéit.Et gëtt wäit an PCR Reaktiounen wéi Taq Enzym benotzt, awer et huet méi héich Hëtztresistenz wéi Taq Enzym, sou datt et och e besseren Effekt op PCR mat héije GC Inhalt Templates huet.

· Dëst Enzym huet grondsätzlech keng 3′→5′ Exonuclease Aktivitéit an 5′→3′ Exonuclease Aktivitéit, sou datt et och fir Dideoxy Sequenzéierung benotzt ka ginn.

· Dëst Enzym huet RTase Aktivitéit.A Präsenz vu Mn2+ gëtt d'RTase Aktivitéit verbessert.Mat dëser Fonktioun kann et benotzt ginn fir ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun a PCR Reaktioun am selwechte Rouer auszeféieren, dat heescht een-Schrëtt RT-PCR.Wéi och ëmmer, a Präsenz vu Mn2+ ass d'Genauegkeet vum RT-PCR net héich.RT Aktivitéit huet näischt mat rnaase H Aktivitéit ze maachen.

· Déi erhéicht Aktivitéit vun Tth-DNA Polymerase (pH9, optimal +55℃～+70℃, maximal +95℃) iwwerwannt d'Problemer, déi duerch RNA sekundär Struktur verursaacht ginn.Déi resultéierend cDNA kann duerch PCR mat deemselwechten Enzym a Präsenz vu Mg2+ Ionen amplifizéiert ginn.

· D'Kapazitéit vun der Tth-DNA-Polymerase fir ëmgedréint Transkriptioun an DNA-Verstäerkung bei héijen Temperaturen auszeféieren mécht dësen Enzym nëtzlech fir quantitativ RT-PCR, Klonen a Genausdrocksanalyse vun cellulärer a viraler RNA.
· Tth-DNA Polymerase gëtt fir RT-PCR benotzt fir RNA bis zu 1kb ze verstäerken.

Fonctiounen a Virdeeler

Tth DNA Polymerase:

• Assuréieren d'optimiséiert Polymerase Kettenreaktioun (PCR) Produktgréisst, op d'mannst 1000 bp an der RT-PCR Reaktioun

• Akzeptéiert modifizéiert Deoxyribonucleosid Triphosphat als Substrat

• Net Zesummenhang mat RNase H Aktivitéit

• Huet eng héich thermesch Stabilitéit fir Problemer ze iwwerwannen, normalerweis am Zesummenhang mat der héijer sekundärer Struktur, déi am RNA präsent ass

RevTaq RT-PCR DNA Polymerase

Eng Hëtzt-resistent DNA Polymerase mat ëmgedréint Transkriptase Aktivitéit

RevTaq-RT-PCR-DNA Polymerase ass en manipuléierten, héich Hëtztbeständeg, duebel-funktionell Enzym mat ëmgedréint Transkriptase an DNA Polymerase Aktivitéite kritt duerch geriicht a kënschtlech Evolutioun.

· D'Hallefzäit vum RevTaq RT-PCR DNA Polymerase bei 95 ° C ass méi wéi 40 Minutten.

· RevTaq RT-PCR DNA Polymerase erlaabt héich-Temperatur ëmgedréint Transkriptioun direkt vun der RNA Schabloun, an der ëmgedréint Transkriptiouns Schrëtt kann e puer mol widderholl ginn fir méi cDNA Templates ze generéieren.

· RevTaq RT-PCR DNA Polymerase erlaabt "Null-Schrëtt" RT-PCR (keng isothermesch ëmgedréint Transkriptiounsschrëtt), well an der zyklescher PCR Verlängerungsschrëtt, ëmgedréint Transkriptioun an DNA Verstäerkung gläichzäiteg geschitt.Dëst fördert och déi ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun bei héijen Temperaturen, an doduerch d'Problemer ze minimiséieren, déi bei der Schmelzung vun der staarker sekundärer Struktur am RNA bei héijen Temperaturen opgetruede sinn.

· Wéinst der aptamer-baséiert Hot-Start Formel, RevTaq RT-PCR DNA Polymerase wäert besser Resultater produzéiere wann d'annealing an Extensioun Temperatur méi héich wéi 57 ° C ass.

· Well den Enzym hëtzebeständeg ass, ass et recommandéiert Primer a Sonden mat ganz héije Schmelzpunkten (>60°C) ze designen.

· Et ass recommandéiert d'Temperatur vun der annealing / Extensioun Schrëtt duerch e Temperaturgradient während der Reaktioun Setup Prozess ze optimiséieren.

· Wat méi héich d'Temperatur ass, wat méi héich ass d'Spezifizitéit vum PCR.De ëmgedréint Transkriptiounszyklus gëtt normalerweis bei enger méi héijer Temperatur ausgeführt wéi de PCR Zyklus, well DNA Primer: RNA Template Hybridiséierung huet normalerweis e méi héije Schmelzpunkt wéi DNA Primer: cDNA Template Duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA Polymerase ass genetesch manipuléiert an optimiséiert, an der Amplicon Gréisst ass tëscht 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA Polymerase Detektioun Limit erreecht 4 Exemplare/

D'optimiséiert Reaktioun System (d'Etablissement vun héich Schmelzpunkt primers) ass an der Figur gewisen.RevTaq RT-PCR DNA Polymerase-Undriff RT-PCR weist besser Empfindlechkeet wéi TaqPath 1-Schrëtt RT-qPCR Master Mix, a manner Detektioun Probe Verdünnungsgradient.

Méi Virdeeler:

Schnellstartfunktioun → Den initialen thermesche Denaturatiounsschrëtt kann iwwersprongen ginn.

Hot-Start Aptamer Formel → Gitt 100% Enzymaktivitéit direkt a vermeit net spezifesch Amplifikatioun bei niddregen Temperaturen (<57 °C).

Spaltfunktioun → De RNA-Extraktiounsschrëtt gëtt ausgelooss, well RevTaq RT-PCR DNA-Polymerase kann och rau Reaktiounsproben veraarbechten.Et kann direkt d'Zellmembranen vun Eukaryoten, Bakterien a Viren an engem waarme RT-PCR-Zyklus zerstéieren.

IVD Rohmaterial Niveau → héich Qualitéitsnormen an extrem kompetitiv Präisser