Startmaterial: RNA
Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR) ass eng experimentell Method déi an PCR Experimenter benotzt gëtt mat RNA als Ausgangsmaterial.An dëser Method gëtt total RNA oder Messenger RNA (mRNA) fir d'éischt an komplementär DNA (cDNA) duerch ëmgedréint Transkriptase transkribéiert.Duerno gouf eng qPCR Reaktioun mat der cDNA als Schabloun gemaach.RT-qPCR gouf an enger Rei vu molekulare Biologie Uwendungen benotzt, dorënner Genausdrock Analyse, RNA Interferenz Validatioun, Microarray Validatioun, Pathogenen Detektioun, genetesch Tester, a Krankheet Fuerschung.
Ee-Schrëtt an zwee-Schrëtt Methode fir RT-qPCR
RT-qPCR kann duerch eng een-Schrëtt oder zwee-Schrëtt Method erreecht ginn.One-Step RT-qPCR kombinéiert ëmgedréint Transkriptioun a PCR Amplifikatioun, wat et erlaabt ëmgedréint Transkriptase an DNA Polymerase d'Reaktioun am selwechte Rouer ënner de selwechte Pufferbedéngungen ze kompletéieren.One-Schrëtt RT-qPCR verlaangt nëmmen d'Benotzung vun Sequenz-spezifesch primers.An zwee-Schrëtt RT-qPCR, ëmgedréint Transkriptioun an PCR Amplifikatioun sinn an zwee Réier duerchgefouert, mat verschiddene optimiséiert Puffer, Reaktioun Konditiounen, a Primer Design Strategien.
Virdeel | Nodeel | |
Ee Schrëtt | Dës Method huet manner experimentell Feeler well béid Reaktiounen an engem Rouer gemaach ginn
Manner Pipette Schrëtt reduzéieren de Risiko vu Kontaminatioun
Gëeegent fir High-Throughput Amplifikatioun / Screening, séier a reproduzéierbar | Zwee-Schrëtt Reaktiounen kënnen net separat optimiséiert ginn
Zënter datt d'Reaktiounsbedéngungen kompromittéiert ginn andeems d'Zwee-Schrëtt Reaktioun kombinéiert ass, ass d'Sensibilitéit net sou gutt wéi déi vun der Zwee-Schrëtt Method.
D'Zuel vun Ziler, déi vun enger eenzeger Probe festgestallt goufen, ass kleng |
Zwee Schrëtt | D'Kapazitéit fir stabil cDNA Bibliothéiken ze kreéieren déi fir laang Zäit gespäichert kënne ginn a a multiple Reaktiounen benotzt kënne ginn
Zilgenen a Referenzgenen kënnen aus der selwechter cDNA Bibliothéik verstäerkt ginn ouni de Besoin vu multiple cDNA Bibliothéiken
Reaktiounsbufferen a Reaktiounsbedéngungen déi Optimisatioun vun eenzelne Reaktiounslafe erméiglechen
Flexibel Auswiel vun Ausléiserbedéngungen | Mat Multiple Réier, a méi Pipette Schrëtt erhéicht de Risiko vun der DNA Kontaminatioun, an Zäit Konsuméiere.
Erfuerdert méi Optimiséierung wéi déi eenzeg Schrëtt Method |
Zesummenhang Produkter:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Gréng I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Fir Éischt-Strand CDNA Synthese
Echtzäit PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Selektioun vun total RNA an mRNA
Wann Dir en RT-qPCR Experiment designt, ass et wichteg ze entscheeden ob total RNA oder gereinegt mRNA als Schabloun fir ëmgedréint Transkriptioun benotzt gëtt.Och wann mRNA fäeg ass e bësse méi héich Sensibilitéit ze bidden, gëtt total RNA ëmmer nach dacks benotzt.De Grond dofir ass datt total RNA e méi wichtege Virdeel als Startmaterial huet wéi mRNA.Als éischt erfuerdert de Prozess manner Reinigungsschrëtt, wat eng besser quantitativ Erhuelung vun der Schabloun a bessere Normaliséierung vun de Resultater fir d'Startzellnummeren garantéiert.Zweetens vermeit et de mRNA-Beräicherungsschrëtt, wat d'Méiglechkeet vu verréckten Resultater vermeide kann wéinst verschiddene Erhuelunge vu verschiddene mRNAs.Am Allgemengen, well an de meeschte Uwendungen déi relativ Quantifikatioun vum Zilgen méi wichteg ass wéi déi absolut Sensibilitéit vun der Detektioun, ass total RNA an de meeschte Fäll méi gëeegent.
Reverse Transkriptiouns Primer
An der zwee-Schrëtt Method kënnen dräi verschidde Methoden benotzt ginn fir d'cDNA Reaktioun ze priméieren: Oligo (dT) Primer, zoufälleg Primer oder Sequenzspezifesch Primer.Typesch ginn Oligo (dT) Primer a zoufälleg Primer a Kombinatioun benotzt.Dës Primer anneal un de Schabloun mRNA Strang a bidden ëmgedréint Transkriptase mat engem Startpunkt fir Synthese.
Primer Auswiel | Struktur a Funktioun | Virdeel | Nodeel |
Oligo(dT) Primer (oder verankert Oligo(dT) Primer) | Verlängert annealing zu thymine Reschter um poly (A) Schwäif vun mRNA;Anker oligo (dT) Primer enthält e G, C oder A um 3' Enn (Ankerplaz) | Synthese vu Volllängt cDNA aus poly(A)-tailed mRNA
Uwendbar wann manner Ausgangsmaterial verfügbar ass
Verankerungsplaz garantéiert datt den Oligo (dT) Primer un de 5' Poly (A) Schwanz vun der mRNA bindt | Nëmme gëeegent fir Genen mat Poly(A) Schwänz ze verstäerken
Kritt cDNA ofgeschnidden vun der Primerplaz * 2 am Poly(A)
Biased fir un den 3′ Enn ze binden *
* Dës Méiglechkeet gëtt miniméiert wann verankert Oligo (dT) Primer benotzt ginn |
zoufälleg primer
| 6 bis 9 Basen an der Längt, déi op verschidde Site während der RNA Transkriptioun anneal kënnen | Anneal un all RNAs (tRNA, rRNA, a mRNA)
Gëeegent fir Transkriptiounen mat bedeitend sekundärer Struktur, oder wann manner Ausgangsmaterial verfügbar ass
Héich cDNA Yield | cDNA gëtt ëmgedréint vun all RNA transkribéiert, wat normalerweis net gewënscht ass a kann d'Signal vun der Zil-mRNA verdünnen
ofgeschnidden cDNA kréien |
Sequenzspezifesch Primer | Benotzerdefinéiert Primer déi spezifesch mRNA Sequenzen zielen | spezifesch cDNA Bibliothéik
Sensibilitéit verbesseren
Benotzt ëmgedréint qPCR Primer | Nëmme limitéiert op d'Synthese vun engem eenzegen Zilgen |
Reverse Transkriptase
Reverse Transkriptase ass en Enzym dat RNA benotzt fir DNA ze synthetiséieren.E puer ëmgedréint Transkriptasen hunn RNase Aktivitéit a kënnen RNA Strécke an RNA-DNA Hybrid Strécke no Transkriptioun ofbauen.Wann et keng RNase enzymatesch Aktivitéit huet, kann RNaseH fir méi héich qPCR Effizienz bäigefüügt ginn.Allgemeng benotzt Enzyme enthalen Moloney murine Leukämie Virus ëmgedréint Transkriptase an Avian Myeloblastoma Virus ëmgedréint Transkriptase.Fir RT-qPCR ass et ideal fir eng ëmgedréint Transkriptase mat méi héijer Thermostabilitéit ze wielen, sou datt cDNA Synthese bei méi héijen Temperaturen ausgefouert ka ginn, fir eng erfollegräich Transkriptioun vun RNAs mat méi héijer sekundärer Struktur ze garantéieren, wärend hir voll Aktivitéit uechter d'Reaktioun behalen, wat zu méi héije cDNA-Ausbezuelen resultéiert.
Zesummenhang Produkter:
Foreasy M-MLV Reverse Transkriptase
RNase H Aktivitéit vu Reverse Transkriptase
RNaseH ass fäeg RNA Strécke vun RNA-DNA Duplexen ze degradéieren, wat effizient Synthese vun Duebelstreng DNA erlaabt.Wéi och ëmmer, wann Dir laang mRNA als Schabloun benotzt, kann d'RNA virzäiteg degradéiert ginn, wat zu ofgeschniddene cDNA resultéiert.Dofir ass et dacks gutt fir d'RNaseH Aktivitéit während der cDNA Klonen ze minimiséieren wann d'Synthese vu laange Transkriptiounen gewënscht ass.Am Géigesaz, ëmgedréint Transkriptasen mat RNase H Aktivitéit sinn dacks gutt fir qPCR Uwendungen, well se d'Schmelz vun RNA-DNA Duplexe während dem éischten Zyklus vu PCR verbesseren.
Primer Design
PCR primers fir de qPCR Schrëtt am RT-qPCR benotzt soll idealerweis entworf ginn en Exon-Exon Kräizung ze span, wou en amplification primer potenziell eng aktuell Exon-intron Grenz Spann kéint.Zënter Intron-enthale genomesch DNA Sequenzen net amplifizéiert sinn, reduzéiert dësen Design de Risiko vu falsche Positiven, déi aus kontaminéierter genomesch DNA verstäerkt ginn.
Wann Primer net entworf kënne ginn fir Exonen oder Exon-Exon Grenzen ze trennen, kann et néideg sinn RNA Proben mat RNase-gratis DNase I oder dsDNase ze behandelen fir genomesch DNA Kontaminatioun ze läschen.
RT-qPCR Kontroll
Eng ëmgedréint Transkriptiouns negativ Kontroll (-RT Kontroll) soll an all RT-qPCR Experimenter abegraff ginn fir DNA Kontaminatioun z'entdecken (wéi genomesch DNA oder PCR Produkter vu fréiere Reaktiounen).Dës Kontroll enthält all Reaktiounskomponenten ausser ëmgedréint Transkriptase.Zënter ëmgedréint Transkriptioun geschitt net mat dëser Kontroll, wann PCR Amplifikatioun beobachtet gëtt, ass d'Kontaminatioun vun der DNA héchstwahrscheinlech.
Post Zäit: Aug-02-2022