一, Erhéijung der Empfindlechkeet vun der Reaktioun System:

1. Héich Qualitéit RNA isoléieren:

Erfollegräich cDNA Synthese kënnt aus héichqualitativen RNA.Héichqualitativ RNA soll op d'mannst voll Längt sinn a fräi vu Reverse Transkriptase-Inhibitoren wéi EDTA oder SDS.D'Qualitéit vun der RNA bestëmmt de maximale Betrag vun der Sequenzinformatioun déi Dir an cDNA transkriptéiere kënnt.Eng gemeinsam RNA Reinigungsmethod ass eng Een-Schrëtt Method mat Guanidin Isothiocyanat / Säurephenol.Fir Kontaminatioun duerch Spuermengen vun RNase ze vermeiden, muss RNA isoléiert aus RNase-räiche Proben (wéi Bauchspaicheldrüs) a Formaldehyd gespäichert ginn fir héichqualitativ RNA ze erhaalen, besonnesch fir laangfristeg Lagerung.D'RNA extrahéiert aus Rattenleber gouf am Fong ofgebaut nodeems se fir eng Woch am Waasser gelagert goufen, während d'RNA extrahéiert aus Rattenmilz stabil bliwwen ass nodeems se 3 Joer am Waasser gelagert goufen.Zousätzlech si Transkripte méi wéi 4 kb méi empfindlech fir Degradatioun duerch Spuer RNases wéi kleng Transkriptiounen.Fir d'Stabilitéit vu gespäichert RNA Proben ze erhéijen, kann RNA an deioniséierter Formamid opgeléist ginn a bei -70 ° C gelagert ginn.Formamid benotzt fir RNA ze konservéieren muss fräi vu RNA-degradéierende Schutt sinn.RNA aus der Bauchspaicheldrüs kann op d'mannst ee Joer a Formamid konservéiert ginn.Wann Dir virbereet fir RNA ze benotzen, kënnt Dir déi folgend Method benotzen fir RNA auszeschléissen: NaCl op 0,2M addéieren a 4 Mol de Volume vun Ethanol, Plaz bei Raumtemperatur fir 3-5 Minutten, an centrifuge bei 10.000 × g fir 5 Minutten.

2. Benotzt d'RNaseH-inaktiv (RNaseH-) ëmgedréint Transkriptase:

RNase Inhibitoren ginn dacks bäigefüügt fir ëmgedréint Transkriptiounsreaktiounen fir d'Längt an d'Ausbezuelung vun der cDNA Synthese ze erhéijen.RNase Inhibitoren solle während der éischter-Sträng Synthese Reaktioun a Präsenz vun engem Puffer an engem Reduktioun Agent (wéi DTT) dobäi ginn, well de Prozess virun cDNA Synthes den Inhibitor denaturéiert, doduerch gebonne RNase fräiginn, datt RNA degradéiere kann.Protein RNase Inhibitoren verhënneren nëmmen d'Degradatioun vun RNA duerch RNase A, B, C, a verhënneren net RNase op der Haut, also passt virsiichteg net RNase vun Äre Fangeren anzeféieren trotz der Benotzung vun dësen Inhibitoren.

Reverse Transkriptase katalyséiert d'Konversioun vu RNA op cDNA.Béid M-MLV an AMV hunn endogen RNaseH Aktivitéit zousätzlech zu hirer eegener Polymerase Aktivitéit.RNaseH Aktivitéit a Polymerase Aktivitéit konkurréiere matenee fir den Hybridstreng geformt tëscht der RNA Schabloun an dem DNA Primer oder cDNA Verlängerungsstreng, an degradéieren den RNA Strang am RNA:DNA Komplex.D'RNA Template, déi duerch RNaseH Aktivitéit ofgebaut gëtt, kann net méi als effektiv Substrat fir d'cDNA Synthese déngen, wat d'Ausbezuelung an d'Längt vun der cDNA Synthese reduzéiert.Dofir wier et gutt fir d'RNaseH Aktivitéit vu Reverse Transkriptase ze eliminéieren oder staark ze reduzéieren..

SuperScript Ⅱ ëmgedréint Transkriptase, RNaseH-MMLV ëmgedréint Transkriptase an thermoScript ëmgedréint Transkriptase, RNaseH-AMV, kënne méi Betrag a méi Volllängt cDNA kréien wéi MMLV an AMV.RT-PCR Sensibilitéit gëtt vum Betrag vun der cDNA Synthese beaflosst.ThermoScript ass vill méi sensibel wéi AMV.D'Gréisst vun RT-PCR Produkter ass limitéiert duerch d'Fäegkeet vu Reverse Transkriptase fir cDNA ze synthetiséieren, besonnesch wann Dir méi grouss cDNAs klonet.Am Verglach mam MMLV huet SuperScripⅡ d'Ausbezuele vu laange RT-PCR Produkter wesentlech erhéicht.D'RNaseH-Reverse Transkriptase huet och eng Thermostabilitéit erhéicht, sou datt d'Reaktioun bei Temperaturen méi héich wéi déi normal 37-42 ° C ausgefouert ka ginn.Ënnert der proposéiert Synthes Konditiounen, benotzen oligo (dT) primer an 10 μCi vun [α-P] dCTP.De Gesamtbetrag vum éischte Strang gouf mat der TCA Nidderschlagsmethod berechent.Volllängt cDNA gouf analyséiert mat Gréisst-sortéierte Bands ausgeschnidden an op enger alkalescher Agarosegel gezielt.

3. Erhéije d'Inkubatiounstemperatur fir ëmgedréint Transkriptioun:

Eng méi héich Inkubatiounstemperatur hëlleft der RNA sekundär Struktur opzemaachen, d'Ausbezuele vun der Reaktioun erhéijen.Fir déi meescht RNA Templates, Inkubatioun vun der RNA a Primer bei 65 ° C ouni Puffer oder Salz, gefollegt vu schnelle Ofkillung op Äis wäert déi meescht sekundär Strukturen eliminéieren an erlaben Primer ze binden.Wéi och ëmmer, e puer Templates hunn nach ëmmer sekundär Strukturen, och no der Hëtztdenaturatioun.Amplifikatioun vun dëse schwieregen Templates ka mat ThermoScript Reverse Transcriptase ausgeführt ginn an d'Reverse Transkriptiounsreaktioun bei enger méi héijer Temperatur setzen fir d'Verstäerkung ze verbesseren.Méi héich Inkubatiounstemperaturen kënnen och Spezifizitéit erhéijen, besonnesch wann genspezifesch Primer (GSP) fir cDNA Synthese benotzt ginn (kuckt Kapitel 3).Wann Dir GSP benotzt, gitt sécher datt den Tm vun de Primer d'selwecht ass wéi déi erwaart Inkubatiounstemperatur.Benotzt net Oligo (dT) a zoufälleg Primer iwwer 60 ° C.Zoufälleg Primer erfuerderen Inkubatioun bei 25 ° C fir 10 Minutten ier se op 60 ° C eropgoen.Zousätzlech fir eng méi héich ëmgedréint Transkriptiounstemperatur ze benotzen, kann d'Spezifizitéit och verbessert ginn andeems d'RNA / Primer Mëschung direkt vun der 65 ° C Denaturatiounstemperatur op d'Reverse Transkriptiounsinkubatiounstemperatur transferéiert gëtt an eng virgewiermt 2 × Reaktiounsmëschung (cDNA Hot-Start Synthese) bäidréit.Dës Approche hëlleft d'intermolekulare Basispaarung ze verhënneren, déi bei méi nidderegen Temperaturen geschitt.Déi multiple Temperaturschaltung erfuerderlech fir RT-PCR kann vereinfacht ginn andeems en thermesche Cycler benotzt.

Tth thermostabil Polymerase handelt als DNA Polymerase a Präsenz vu Mg2+ an als RNA Polymerase a Präsenz vu Mn2+.Et kann bei enger maximaler Temperatur vu 65°C waarm gehal ginn.Wéi och ëmmer, d'Präsenz vu Mn2+ wärend PCR reduzéiert Vertrauen, wat d'Tth Polymerase manner gëeegent mécht fir héich Präzisioun Amplifikatioun, wéi zum Beispill Klonen vu cDNA.Zousätzlech huet Tth eng niddereg ëmgedréint Transkriptiounseffizienz, wat d'Sensibilitéit reduzéiert, a well ëmgedréint Transkriptioun a PCR mat engem eenzegen Enzym kënne gemaach ginn, kënnen d'Kontrollreaktiounen ouni ëmgedréint Transkriptioun net benotzt ginn fir cDNA Amplifikatiounsprodukter mat kontaminéierter genomesch DNA ze vergläichen.D'Verstäerkungsprodukter goufen getrennt.

4. Additive déi ëmgedréint Transkriptioun förderen:

Additiven dorënner Glycerol an DMSO ginn an d'éischt-Sträng Synthese Reaktioun bäigefüügt, wat d'Stabilitéit vun der Nukleinsäure Duebelstrang reduzéiere kann an d'sekundär Struktur vun der RNA ofbriechen.Bis zu 20% Glycerol oder 10% DMSO kënne bäigefüügt ginn ouni SuperScript II oder MMLV Aktivitéit ze beaflossen.AMV kann och bis zu 20% Glycerin toleréieren ouni Aktivitéitsverloscht.Fir d'Sensibilitéit vum RT-PCR an der SuperScriptⅡ ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun ze maximéieren, kann 10% Glycerin derbäigesat ginn a bei 45°C inkubéiert ginn.Wann 1/10 vum ëmgedréint Transkriptiounsreaktiounsprodukt op PCR bäigefüügt gëtt, dann ass d'Konzentratioun vu Glycerol an der Amplifikatiounsreaktioun 0,4%, wat net genuch ass fir PCR ze hemmen.

5. RNaseH behandelen:

D'Behandlung vu cDNA Synthesereaktiounen mat RNaseH virum PCR kann d'Sensibilitéit erhéijen.Fir e puer Template gëtt et geduecht datt RNA an der cDNA Synthesereaktioun d'Bindung vun Amplifikatiounsprodukter verhënnert, an deem Fall d'RNaseH Behandlung d'Sensibilitéit erhéijen.Allgemeng ass d'RNaseH Behandlung noutwendeg wann Dir méi laang cDNA Zil Templates amplifizéiert, sou wéi Low-Copy tuberous Scherosis II.Fir dës schwiereg Schabloun huet d'RNaseH Behandlung d'Signal verbessert, déi duerch SuperScript II oder AMV-synthetiséiert cDNA produzéiert gëtt.Fir déi meescht RT-PCR Reaktiounen ass RNaseH Behandlung fakultativ, well de PCR Denaturatiounsschrëtt bei 95 ° C allgemeng d'RNA am RNA: DNA Komplex hydrolyséiert.

6. Verbesserung vun der klenger RNA Detektiounsmethod:

RT-PCR ass besonnesch Erausfuerderung wann nëmme kleng Quantitéiten un RNA verfügbar sinn.Glycogen bäigefüügt als Träger wärend der RNA Isolatioun hëlleft d'Ausbezuele vu klenge Proben ze erhéijen.RNase-gratis Glykogen kann zur selwechter Zäit wéi Trizol derbäigesat ginn.Glycogen ass Waasserléislech a kann an der wässerlecher Phase mat RNA gehale ginn fir spéider Nidderschlag ze hëllefen.Fir Proben manner wéi 50 mg Tissue oder 106 kultivéiert Zellen ass d'recommandéiert Konzentratioun vu RNase-fräie Glykogen 250 μg / ml.

D'acetyléiert BSA zu der ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun mat SuperScript II bäizefügen kann d'Sensibilitéit erhéijen, a fir kleng Quantitéiten un RNA, d'Quantitéit vum SuperScript II ze reduzéieren an 40 Unitéiten vum RNaseOut Nuklease-Inhibitor ze addéieren kann den Niveau vun der Detektioun erhéijen.Wann Glykogen am RNA Isolatiounsprozess benotzt gëtt, ass et nach ëmmer recommandéiert BSA oder RNase Inhibitor derbäi ze ginn wann Dir SuperScript II fir ëmgedréint Transkriptiounsreaktioun benotzt.

二, Erhéijung RT-PCR Spezifizitéit

1. CND Asynthese:

Éischt-Sträng cDNA Synthese kann mat dräi verschidde Methoden initiéiert ginn, déi relativ Spezifizitéit vun deenen d'Quantitéit an d'Art vun der synthetiséierter cDNA beaflosst.

Déi zoufälleg Primermethod war déi mannst spezifesch vun den dräi Methoden.Primer anneal op verschidde Siten am ganzen Transkript, generéiere kuerz, deelweis Längt cDNAs.Dës Method gëtt dacks benotzt fir 5′ Endsequenzen ze kréien an cDNA aus RNA Templates mat Regioune vun der sekundärer Struktur oder mat Terminatiounsplazen ze kréien, déi net duerch ëmgedréint Transkriptase replizéiert kënne ginn.Fir de längsten cDNA ze kréien, muss de Verhältnis vu Primer zu RNA an all RNA Probe empiresch bestëmmt ginn.D'Startkonzentratioun vu zoufälleg Primer gounge vu 50 bis 250 ng pro 20 μl Reaktioun.Zënter cDNA synthetiséiert aus total RNA mat zoufälleg Primer ass haaptsächlech ribosomal RNA, Poly(A) + RNA gëtt allgemeng als Schabloun gewielt.

Oligo (dT) Primer si méi spezifesch wéi zoufälleg Primer.Et hybridiséiert mam Poly(A) Schwanz, deen um 3'Enn vun de meescht eukaryotesche mRNAs fonnt gëtt.Well Poly(A)+ RNA ongeféier 1% bis 2% vum Gesamt-RNA ass, ass d'Quantitéit an d'Komplexitéit vu cDNA vill manner wéi mat zoufälleg Primer.Wéinst senger héijer Spezifizitéit erfuerdert Oligo (dT) allgemeng keng Optimiséierung vum Verhältnis vu RNS zu Primer a Poly (A) + Selektioun.Et ass recommandéiert 0,5μg Oligo (dT) pro 20μl Reaktiounssystem ze benotzen.oligo(dT)12-18 ass gëeegent fir déi meescht RT-PCR.Den ThermoScript RT-PCR System bitt Oligo(dT)20 wéinst senger besserer thermescher Stabilitéit fir méi héich Inkubatiounstemperaturen.

Gen spezifesch Primer (GSP) sinn déi spezifesch Primer fir de ëmgedréint Transkriptiouns Schrëtt.GSP ass en Antisense Oligonukleotid dee spezifesch zu der RNA Zilsequenz hybridize kann, am Géigesaz zu zoufälleg Primer oder Oligo (dT), déi un all RNAs annealéieren.Déi selwecht Regele benotzt fir PCR Primer ze designen gëllen fir den Design vum GSP bei ëmgedréint Transkriptiounsreaktiounen.De GSP kann déiselwecht Sequenz sinn wéi den Amplifikatiounsprimer deen un den 3'-meeschten Enn vun der mRNA anneals, oder de GSP kann entworf ginn fir downstream vum ëmgedréint Amplifikatiounsprimer ze anneal.Fir e puer amplifizéiert Themen, muss méi wéi een antisense Primer fir erfollegräich RT-PCR entworf ginn, well d'sekundär Struktur vun der Zil-RNA kann d'Primerbindung verhënneren.Et ass recommandéiert 1 pmol Antisense GSP an enger 20 μl Éischt-Sträng Synthese Reaktioun ze benotzen.

2. Erhéije d'Inkubatiounstemperatur fir ëmgedréint Transkriptioun:

Fir voll Virdeel vun der GSP Spezifizitéit ze profitéieren, sollt eng ëmgedréint Transkriptase mat méi héijer Thermostabilitéit benotzt ginn.Thermostabel ëmgedréint Transkriptase kënne bei méi héijen Temperaturen inkubéiert ginn fir d'Reaktiounsstringenz ze erhéijen.Zum Beispill, wann e GSP bei 55 ° C anneals, gëtt d'Spezifizitéit vum GSP net voll genotzt wann AMV oder M-MLV fir ëmgedréint Transkriptioun bei enger niddereger Stringenz vun 37 ° C benotzt gëtt.Wéi och ëmmer, SuperScript II an ThermoScript kënne bei 50 ° C oder méi reagéiert ginn, wat net spezifesch Produkter eliminéiert, déi bei méi nidderegen Temperaturen generéiert ginn.Fir maximal Spezifizitéit kann d'RNA / Primer Mëschung direkt vun der 65 ° C Denaturatiounstemperatur op d'Reverse Transkriptiouns Inkubatiounstemperatur transferéiert ginn an zu enger virgewiermter 2 × Reaktiounsmix (cDNA Synthese Hot Start) bäigefüügt ginn.Dëst hëlleft intermolekulare Basispaart bei niddregen Temperaturen ze verhënneren.Déi multiple Temperaturiwwergäng, déi fir RT-PCR erfuerderlech sinn, kënne vereinfacht ginn andeems en thermesche Cycler benotzt.

3. Reduzéiert genomesch DNA Kontaminatioun:

Eng potenziell Schwieregkeet, déi mat RT-PCR begéint ass, ass d'Kontaminatioun vu genomesch DNA an der RNA.Mat enger gudder RNA Isolatiounsmethod, wéi Trizol Reagens, wäert d'Quantitéit u genomesch DNA reduzéieren, déi d'RNA Virbereedung kontaminéiert.Fir Produkter aus genomesch DNA ze vermeiden, kann RNA mat Amplifikatioun-Grad DNase I behandelt ginn fir kontaminéiert DNA virum ëmgedréint Transkriptioun ze läschen.D'DNase I Verdauung gouf ofgeschloss andeems d'Proben an 2.0 mM EDTA fir 10 Minutten bei 65 ° C inkubéieren.EDTA kann Magnesiumionen chelatéieren, Magnesiumion-ofhängeg RNA Hydrolyse bei héijen Temperaturen verhënneren.

Fir amplifizéiert cDNA vu kontaminéierte genomesche DNA Amplifikatiounsprodukter ze trennen, kënnen Primer entworf ginn, déi all Anneal fir Exonen ze trennen.PCR Produkter ofgeleet vu cDNA wäerte méi kuerz sinn wéi déi aus kontaminéierter genomesch DNA ofgeleet.Zousätzlech gouf e Kontrollexperiment ouni ëmgedréint Transkriptioun op all RNA Schabloun gemaach fir ze bestëmmen ob e bestëmmte Fragment aus genomesch DNA oder cDNA ofgeleet gouf.De PCR Produkt kritt ouni ëmgedréint Transkriptioun ass aus dem Genom ofgeleet.