Molekulare Diagnostik Technologie benotzt molekulare Biologie Methoden fir den Ausdrock an d'Struktur vum genetesche Material vum mënschleche Kierper a verschidde Pathogenen z'entdecken, fir den Zweck ze erreechen fir Krankheeten virauszesoen an ze diagnostizéieren.

An de leschte Joeren, mat der Upgrade an Iteratioun vun molekulare Diagnostic Technologie, ass d'klinesch Applikatioun vun molekulare Diagnostik ëmmer méi extensiv an am-Déift ginn, an de molekulare Diagnostice Maart ass eng Period vun rapid Entwécklung koum.

Den Auteur resüméiert déi gemeinsam molekulare diagnostesch Technologien um Maart, an ass an dräi Deeler opgedeelt: den éischten Deel stellt d'PCR Technologie vir, den zweeten Deel féiert d'Nukleinsäure isothermesch Amplifikatiounstechnologie vir, an den zweeten Deel féiert d'Sequenzéierungstechnologie.

01

Deel I: PCR Technologie

PCR Technologie

PCR (Polymerase Kettenreaktioun) ass eng vun den in vitro DNA Amplifikatiounstechnologien, mat enger Geschicht vu méi wéi 30 Joer.

PCR Technologie gouf am Joer 1983 vum Kary Mullis vu Cetus, USA gepionéiert.De Mullis huet 1985 e PCR Patent ugewannt an am selwechte Joer den éischte PCR akademesche Pabeier iwwer Wëssenschaft publizéiert.De Mullis huet 1993 den Nobelpräis an der Chimie gewonnen.

Grondprinzipien vun PCR

PCR kann Zil-DNA Fragmenter ëm méi wéi eng Millioun Mol amplify.De Prinzip ass datt ënner der Katalyse vun DNA Polymerase den Elterendeel DNA als Schabloun benotzt gëtt, an e spezifesche Primer gëtt als Startpunkt fir d'Verlängerung benotzt.Et gëtt replizéiert in vitro duerch Schrëtt wéi Denaturatioun, annealing, an Extensioun.De Prozess vun der Duechterstreng DNA komplementär zum Elterendeel Strang Template DNA.

De Standard PCR Prozess ass an dräi Schrëtt opgedeelt:

1. Denaturatioun: Benotzt héich Temperatur fir DNA Duebelstrengen ze trennen.D'Waasserstoffverbindungen tëscht DNA Duebelstrenge gi bei héijen Temperaturen (93-98°C) gebrach.

2. Annealing: Nodeems d'duebelstrengend DNA getrennt ass, gëtt d'Temperatur erofgesat, sou datt de Primer un d'eenzelstrengend DNA binde kann.

3. Verlängerung: D'DNA-Polymerase fänkt un komplementär Strécke laanscht d'DNA Strécke vun de Primer gebonnen ze synthetiséieren wann d'Temperatur erofgesat gëtt.Wann d'Verlängerung fäerdeg ass, gëtt en Zyklus ofgeschloss, an d'Zuel vun DNA Fragmenter verduebelt.

Widderhuelend dës dräi Schrëtt 25-35 Mol, wäert d'Zuel vun DNA Fragmenter exponentiell eropgoen.

D'Ingeniitéit vum PCR ass datt verschidde Primer fir verschidden Zilgenen entworf kënne ginn, sou datt d'Zilgenfragmenter a kuerzer Zäit amplifizéiert kënne ginn.

Bis elo kann PCR an dräi Kategorien opgedeelt ginn, nämlech gewéinlech PCR, fluoreszent quantitativ PCR an digital PCR.

Déi éischt Generatioun vum gewéinleche PCR

Benotzt e gewéinleche PCR Verstäerkungsinstrument fir den Zilgen ze verstäerken, a benotzt dann Agarosegel Elektrophorese fir de Produkt z'entdecken, nëmme qualitativ Analyse kann gemaach ginn.

D'Haaptnodeeler vun der éischter Generatioun PCR:

-Prone fir net spezifesch Amplifikatioun a falsch positiv Resultater.

-D'Detektioun dauert laang an d'Operatioun ass ëmständlech.

- Nëmme qualitativ Tester kënne gemaach ginn.

Zweet Generatioun Fluoreszenz quantitative PCR

Fluoreszenz quantitative PCR (Real-Time PCR), och bekannt als qPCR, gëtt benotzt fir d'Akkumulation vu verstäerkte Produkter duerch d'Akkumulatioun vu fluoreszent Signaler ze iwwerwaachen andeems fluoreszent Sonden bäigefüügt ginn, déi de Fortschrëtt vum Reaktiounssystem uginn, an d'Resultater duerch d'Fluoreszenzkurve ze beurteelen, an Et kann quantifizéiert ginn mat der Standardkurvewäert an Hëllef.

Well d'qPCR Technologie an engem zouenen System duerchgefouert gëtt, gëtt d'Wahrscheinlechkeet vun der Kontaminatioun reduzéiert, an de Fluoreszenzsignal kann fir quantitativ Detektioun iwwerwaacht ginn, sou datt et am meeschte verbreet an der klinescher Praxis benotzt gëtt an déi dominant Technologie am PCR ginn ass.

Déi fluoreszent Substanzen, déi an Echtzäit fluoreszent quantitativen PCR benotzt ginn, kënnen opgedeelt ginn an: TaqMan fluoreszent Sonden, molekulare Beaconen a fluoreszent Faarfstoffer.

1) TaqMan Fluorescent Sonde:

Wärend der PCR Amplifikatioun gëtt eng spezifesch fluoreszent Sonde bäigefüügt wärend e Paar Primer bäigefüügt.D'Sonde ass en Oligonukleotid, an déi zwee Enden si respektiv mat enger Reporter fluoreszenter Grupp an enger Quencher fluoreszenter Grupp gezeechent.

Wann d'Sonde intakt ass, gëtt de fluoreszent Signal, deen vun der Reportergrupp emittéiert gëtt, vun der Quenching-Grupp absorbéiert;während PCR Verstäerkung, der 5'-3' Exonuclease Aktivitéit vun Taq Enzym cleaves an degradéiert der Sonde, mécht de Reporter fluorescent Grupp an quencher. Cence Signal ass komplett mat der Bildung vum PCR Produkt synchroniséiert.

2) SYBR fluoreszent Faarfstoffer:

Am PCR-Reaktiounssystem gëtt en Iwwerschoss vu SYBR-Fluoreszentfärbung bäigefüügt.Nodeems de SYBR fluoreszent Faarf net spezifesch an d'DNA Duebelstreng agebaut ass, emittéiert en e fluoreszent Signal.D'SYBR-Faarfmolekül, déi net an d'Kette agebaut ass, emittéiert kee Fluoreszenz-Signal, sou datt de fluoreszent Signal garantéiert. D'Erhéijung vun de PCR-Produkter ass komplett mat der Erhéijung vun de PCR-Produkter synchroniséiert.SYBR bindt nëmmen un duebelstrengeg DNA, sou datt d'Schmelzkurve ka benotzt ginn fir ze bestëmmen ob d'PCR Reaktioun spezifesch ass.

3) Molekulare Beaconen

Et ass eng Stammschleife duebel-labeléiert Oligonukleotid Sonde déi eng Haarnadelstruktur vun ongeféier 8 Basen op de 5 an 3 Enden bildt.D'Nukleinsäure Sequenzen op béide Enden si komplementär gepaart, wat verursaacht datt d'fluoreszent Grupp an d'Quenching Grupp enk sinn.Zoumaachen, et wäert keng Fluoreszenz produzéieren.

Nodeems de PCR Produkt generéiert ass, wärend dem Glühungsprozess, gëtt de mëttleren Deel vum molekulare Beacon mat enger spezifescher DNA Sequenz gepaart, an de fluoreszent Gen gëtt vum Quencher Gen getrennt fir Fluoreszenz ze produzéieren.

D'Haaptnodeeler vun der zweeter Generatioun PCR:

Sensibilitéit feelt nach ëmmer, an d'Detektioun vu Low-Copy Exemplare ass net korrekt.

Et gëtt Hannergrondwäert Afloss, an d'Resultat ass ufälleg fir Interferenz.

Drëtt Generatioun digital PCR

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) berechent d'Kopienummer vun der Zilsequenz duerch Endpunkterkennung, a ka genee absolut quantitativ Detektioun ausféieren ouni intern Kontrollen a Standardkurven ze benotzen.

Digital PCR benotzt Endpunkterkennung an hänkt net vum Ct-Wäert (Zyklus-Schwell) of, sou datt d'digitale PCR-Reaktioun manner vun der Verstäerkungseffizienz beaflosst gëtt, an d'Toleranz fir PCR-Reaktiounsinhibitoren verbessert, mat héijer Genauegkeet a Reproduktioun.

Wéinst de Charakteristiken vun héich Empfindlechkeet an héich Genauegkeet, ass et net einfach vun PCR Reaktioun inhibitors gestéiert, an et kann richteg absolute Quantifikatioun ouni Standard Produiten erreechen, déi e Fuerschung an Applikatioun Hotspot gouf.

No de verschiddene Formen vun der Reaktioun Eenheet, kann et an dräi Zorte ënnerdeelt ginn: microfluidic, Chip an droplet Systemer.