Real Time PCR, och bekannt als quantitative PCR oder qPCR, ass eng Method fir Echtzäit Iwwerwaachung an Analyse vu PCR Amplifikatiounsprodukter.
Well quantitative PCR d'Virdeeler vun der einfacher Operatioun, séier a praktesch, héich Empfindlechkeet, gutt Wiederholbarkeet, a gerénger Kontaminatiounsquote huet, gëtt et wäit an der medizinescher Tester, Medikamenteffizienz Bewäertung, Genausdrockfuerschung, transgenesch Fuerschung, Gendetektioun, Pathogenenerkennung, Déieren- a Planzerkennung benotzt., Liewensmëttel Testen an aner Felder.
Dofir, egal ob Dir an der Basisfuerschung an de Liewenswëssenschaften engagéiert sidd, oder Mataarbechter vu pharmazeuteschen Firmen, Déierebetribsfirmen, Liewensmëttelfirmen, oder souguer Mataarbechter vun Entrée-Exit Inspektioun a Quarantänbüroen, Ëmweltiwwerwaachungsdepartementer, Spideeler an aner Eenheeten, Dir wäert méi oder manner ausgesat sinn Oder Dir musst d'Wëssen iwwer d'Mastere vu quantitative PCR wëssen.

Prinzip vun Real Time PCR

Echtzäit PCR ass eng Method an där fluoreszent Substanzen zum PCR Reaktiounssystem bäigefüügt ginn, an d'Fluoreszenz Signalintensitéit am Prozess vun der PCR Reaktioun gëtt an Echtzäit duerch e quantitativen PCR Instrument iwwerwaacht, a schliisslech ginn déi experimentell Donnéeën analyséiert a veraarbecht.

【Amplifikatiounskurve】ass d'Kurve déi den dynamesche Prozess vu PCR beschreift.D'Verstäerkungskurve vu PCR ass net tatsächlech eng Standard exponentiell Kurve, awer eng Sigmoidkurve.

[Plattformphase vun der Amplifikatiounskurve]Mat der Erhéijung vun der Unzuel vu PCR-Zyklen, der Inaktivéierung vun der DNA-Polymerase, der Verarmung vun dNTPs a Primer, an der Inhibitioun vun der Synthesereaktioun duerch d'Reaktiouns-Nieweprodukt Pyrophosphat, etc., erweidert de PCR net ëmmer exponentiell., a wäert schlussendlech e Plateau ginn.

[Exponentiell Wuesstumsregioun vun der Amplifikatiounskurve]Och wann d'Plateauphase immens variéiert, an enger bestëmmter Regioun vun der exponentieller Wuesstumsregioun vun der Amplifikatiounskurve ass d'Wiederholbarkeet ganz gutt, wat ganz wichteg ass fir quantitativ Analyse vu PCR.

[Schwellwäert an Ct Wäert]Mir setzen de Grenzwäert vun der Fluoreszenzerkennung op déi entspriechend Positioun am exponentielle Wuesstumsberäich vun der Amplifikatiounskurve, nämlech de Schwellwäert (Threshold).D'Kräizung vum Schwellwäert an der Amplifikatiounskurve ass den Ct-Wäert, dat heescht, de Ct-Wäert bezitt sech op d'Zuel vun den Zyklen (Threshold Cycle) wann de Schwellwäert erreecht gëtt.

D'Grafik hei drënner weist kloer d'Relatioun tëscht der Schwelllinn an der Verstäerkungskurve, dem Schwell an dem Ct-Wäert.

【Wéi quantifizéieren?】

Et gouf duerch mathematesch Theorie bewisen datt de Ct-Wäert eng invers linear Relatioun mam Logarithmus vun der Unzuel vun den initialen Templates huet.Echtzäit PCR iwwerwaacht PCR Verstäerkungsprodukter an Echtzäit a quantifizéiert se während der exponentieller Verstärkungsphase.

Fir all Zyklus vu PCR ass d'DNA exponentiell ëm 2 Mol eropgaang, a séier e Plateau erreecht.

Unzehuelen datt de Betrag vun der Start-DNA A ass₀ No n Zyklen kann den theoreteschen Betrag vum DNA Produkt ausgedréckt ginn:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Dann, wat méi den initialen DNA Betrag A 0 ass, dest méi séier erreecht de Betrag vum verstäerkte Produkt den Detektiounswäert An, an d'Zuel vun den Zyklen beim Erreechen vun An ass de Ct Wäert.Dat ass, wat méi den initialen DNA Betrag A 0 ass, dest méi fréi ass d'Verstäerkungskurve Peaks, an déi entspriechend Zuel vun den Zyklen n ass méi kleng.

Mir maachen Gradientverdünnung vum Standard vu bekannte Konzentratioun a benotzen et als Schabloun fir Real Time PCR, an eng Serie vun Amplifikatiounskurven ginn an gläiche Intervalle an der Uerdnung vum Start DNA Betrag vu méi op manner kritt.No der linearer Bezéiung tëscht dem Ct-Wäert an dem Logarithmus vun der Unzuel vun den Startschablonen, a[Standardkurve] kann erstallt ginn.

Andeems Dir den Ct Wäert vun der Probe mat onbekannter Konzentratioun an d'Standardkurve ersetzt, kann den initialen Template Betrag vun der Probe mat onbekannter Konzentratioun kritt ginn, wat de quantitative Prinzip vun Echtzäit PCR ass.

Detektiounsmethod vun Echtzäit PCR

Real Time PCR detektéiert PCR Amplifikatiounsprodukter andeems d'Fluoreszenzintensitéit am Reaktiounssystem detektéiert gëtt.

Prinzip vun der Fluorescent Dye Embedding Method】

Fluorescent Faarfstoffer, wéi TB Green ® , kann onspezifesch un duebel-strenged DNA an PCR Systemer binden a fluoreszéieren op Bindung.

D'Fluoreszenzintensitéit am Reaktiounssystem ass exponentiell eropgaang mat der Erhéijung vun de PCR Zyklen.Duerch d'Detektioun vun der Fluoreszenzintensitéit kann d'Quantitéit vun der DNA Amplifikatioun am Reaktiounssystem an Echtzäit iwwerwaacht ginn, an dann kann de Betrag vun der Startschabloun an der Probe ëmgedréint geschat ginn.

【Prinzip vun der fluoreszenter Sonde Method】

fluoreszent Sondeass eng Nukleinsäure Sequenz mat enger fluoreszenter Grupp um 5′ Enn an enger Quenching Grupp um 3′ Enn, déi spezifesch un d'Schabloun binde kann.Wann d'Sond intakt ass, gëtt d'Fluoreszenz, déi vum Fluorophore emittéiert gëtt, vun der Quenching-Grupp geläscht a kann net fluoreszen.Wann d'Sond zerstéiert gëtt, trennt d'fluoreszent Substanz sech op a emittéiert Fluoreszenz.

Eng fluoreszent Sonde gëtt zu der PCR Reaktiounsléisung bäigefüügt.Wärend dem Glühungsprozess bindt d'fluoreszent Sonde un déi spezifesch Positioun vun der Schabloun.Wärend dem Extensiounsprozess kann d'5′→3′ Exonuklease Aktivitéit vum PCR Enzym d'fluorescent Sonde zerstéieren, déi mat der Schabloun hybridiséiert ass, an d'fluorescent Substanz gëtt dissoziéiert fir Fluoreszenz ze emittéieren.Duerch d'Erkennung vun der Fluoreszenzintensitéit vun der Sonde am Reaktiounssystem kann den Zweck vun der Iwwerwaachung vun der Amplifikatiounsbetrag vum PCR Produkt erreecht ginn.

【Auswiel vun der Fluoreszenz Detektiounsmethod】

Wann et benotzt gëtt fir Sequenzen mat héijer Homologie z'ënnerscheeden an Multiplex PCR Detektioun auszeféieren wéi SNP Typing Analyse, ass d'fluoreszent Sondemethod irreplaceable.
Fir aner Echtzäit PCR Experimenter kann eng einfach, einfach a bëlleg fluoreszent Chimera Method benotzt ginn.

probesStrong Spezifizitéit, kapabel vun multiplex PCR

Mängel

Héich Spezifizitéit Ufuerderunge fir Verstäerkung;

Multiplex PCR kann net duerchgefouert ginn. Braucht spezifesch Sonden ze designen, héich Käschten;

heiansdo Sonde Design ass schwéier

Zesummenhang Produkter: