PCR (Polymerase Kettenreaktioun) ass eng vun den in vitro DNA Amplifikatiounstechnologien, mat enger Geschicht vu méi wéi 30 Joer.

PCR Technologie war Pionéier vum Kary Mullis vun Cetus, USA an 1983. Mullis applizéiert fir e PCR Patent an 1985 an publizéiert déi éischt PCR akademesch Pabeier op Science am selwechte Joer.De Mullis gouf 1993 fir seng Aarbecht mam Nobelpräis an der Chimie ausgezeechent.

Grondprinzipien vun PCR

PCR kann Zil-DNA Fragmenter ëm méi wéi eng Millioun Mol amplify.De Prinzip ass ënner der Katalyse vun DNA Polymerase, benotzt Elterendeel DNA als Schabloun a spezifesche Primer als Ausgangspunkt fir Verlängerung.Et gëtt replizéiert in vitro duerch Schrëtt wéi Denaturatioun, annealing, an Extensioun.De Prozess vun der Duechterstreng DNA komplementär zum Elterendeel Strang Template DNA.

De Standard PCR Prozess ass an dräi Schrëtt opgedeelt:

1.Denaturatioun: Benotzt héich Temperatur fir DNA Duebelstrengen ze trennen.D'Waasserstoffverbindung tëscht DNA Duebelstrenge gëtt bei héijer Temperatur (93-98 ℃) gebrach.

2.Annealing: Nodeems d'duebelstrengend DNA getrennt ass, senkt d'Temperatur sou datt de Primer un d'Single-strenged DNA binde kann.

3.Extensioun: D'DNA Polymerase fänkt un komplementär Strécke laanscht d'DNA Strécke vun de Primer gebonnen ze synthetiséieren wann d'Temperatur erofgesat gëtt.Wann d'Verlängerung fäerdeg ass, gëtt en Zyklus ofgeschloss, an d'Zuel vun DNA Fragmenter verduebelt

Widderhuelend dës dräi Schrëtt 25-35 Mol, wäert d'Zuel vun DNA Fragmenter exponentiell eropgoen.

D'Ingeniitéit vum PCR ass datt verschidde Primer fir verschidden Zilgenen entworf kënne ginn, sou datt Zilgenfragmenter a kuerzer Zäit amplifizéiert kënne ginn.

Bis elo kann PCR an dräi Kategorien opgedeelt ginn, nämlech gewéinlech PCR, fluoreszent quantitativ PCR an digital PCR.

Déi éischt Generatioun vum gewéinleche PCR

Benotzt e gewéinleche PCR Verstäerkungsinstrument fir den Zilgen ze verstäerken, a benotzt dann Agarosegel Elektrophorese fir de Produkt z'entdecken, nëmme qualitativ Analyse kann gemaach ginn.

D'Haaptnodeeler vun der éischter Generatioun PCR:

1.Prone fir net spezifesch Amplifikatioun a falsch positiv Resultater.

2.D'Detektioun dauert laang an d'Operatioun ass ëmständlech.

3.Only qualitative Test kann gemaach ginn

Zweet Generatioun Real-Time PCR

Echtzäit PCR, och bekannt als qPCR, benotzt fluoreszent Sonden, déi de Fortschrëtt vum Reaktiounssystem uginn, a iwwerwaacht d'Akkumulation vun amplifizéierte Produkter duerch d'Akkumulation vu fluoreszent Signaler, a beurteelt d'Resultater duerch d'Fluoreszenzkurve.Et kann mat der Hëllef vum Cq Wäert a Standardkurve quantifizéiert ginn.

Well d'qPCR Technologie an engem zouenen System duerchgefouert gëtt, gëtt d'Wahrscheinlechkeet vun der Kontaminatioun reduzéiert, an de Fluoreszenzsignal kann fir quantitativ Detektioun iwwerwaacht ginn, sou datt et am meeschte verbreet an der klinescher Praxis benotzt gëtt an déi dominant Technologie am PCR ginn ass.

Déi fluoreszent Substanzen, déi an Echtzäit fluoreszent quantitativen PCR benotzt ginn, kënnen opgedeelt ginn: TaqMan fluoreszent Sonde, molekulare Beaconen a fluoreszent Faarf.

1) TaqMan fluoreszent Sonde:

Wärend der PCR Amplifikatioun gëtt eng spezifesch fluoreszent Sonde bäigefüügt wärend e Paar Primer bäigefüügt.D'Sonde ass en Oligonukleotid, a béid Enden si mat enger Reporter fluoreszenter Grupp an enger Quencher fluoreszenter Grupp gezeechent.

Wann d'Sonde intakt ass, gëtt de fluoreszent Signal, deen vun der Reportergrupp emittéiert gëtt, vun der Quenching-Grupp absorbéiert;während PCR Verstäerkung, der 5'-3' Exonuclease Aktivitéit vun Taq Enzym cleaves an degradéiert der Sonde, mécht de Reporter fluorescent Grupp an quencher. Cence Signal ass komplett mat der Bildung vum PCR Produkt synchroniséiert.

2) SYBR fluoreszent Faarf:

Am PCR-Reaktiounssystem gëtt en Iwwerschoss vu SYBR-Fluoreszentfärbung bäigefüügt.Nodeems de SYBR fluoreszent Faarf net spezifesch an d'DNA Duebelstreng agebaut ass, emittéiert en e fluoreszent Signal.D'SYBR-Faarfmolekül, déi net an d'Kette agebaut ass, emittéiert kee Fluoreszenz-Signal, sou datt de fluoreszent Signal garantéiert. D'Erhéijung vun de PCR-Produkter ass komplett mat der Erhéijung vun de PCR-Produkter synchroniséiert.SYBR bindt nëmmen un duebelstrengeg DNA, sou datt d'Schmelzkurve ka benotzt ginn fir ze bestëmmen ob d'PCR Reaktioun spezifesch ass.

3) Molekulare Beacon:

Et ass eng Stammschleife duebel-labeléiert Oligonukleotid Sonde déi eng Haarnadelstruktur vun ongeféier 8 Basen op de 5 an 3 Enden bildt.D'Nukleinsäure Sequenzen op béide Enden si komplementär gepaart, wat verursaacht datt d'fluoreszent Grupp an d'Quenching Grupp enk sinn.Zoumaache gëtt keng Fluoreszenz produzéiert.

Nodeems de PCR Produkt generéiert ass, wärend dem Glühungsprozess, gëtt de mëttleren Deel vum molekulare Beacon mat enger spezifescher DNA Sequenz gepaart, an de fluoreszent Gen gëtt vum Quencher Gen getrennt fir Fluoreszenz ze produzéieren.

D'Haaptnodeeler vun der zweeter Generatioun PCR:

Sensibilitéit feelt nach ëmmer, an d'Detektioun vu Low-Copy Exemplare ass ongenau.

Et gëtt den Afloss vum Hannergrondwäert, an d'Resultat ass ufälleg fir Interferenz.

Wann et PCR-Inhibitoren am Reaktiounssystem sinn, sinn d'Detektiounsresultater ufälleg fir Interferenz.

Drëtt Generatioun digital PCR

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) berechent d'Kopienummer vun der Zilsequenz duerch Endpunkterkennung, a ka genee absolut quantitativ Detektioun ausféieren ouni intern Kontrollen a Standardkurven ze benotzen.

Digital PCR benotzt Endpunkterkennung an hänkt net vum Ct-Wäert (Zyklus-Schwell) of, sou datt d'digitale PCR-Reaktioun manner vun der Amplifikatiounseffizienz beaflosst gëtt, an d'Toleranz zu PCR-Reaktiounsinhibitoren verbessert, mat héijer Genauegkeet a Reproduktioun.

Wéinst de Charakteristiken vun héich Empfindlechkeet an héich Genauegkeet, ass et net einfach vun PCR Reaktioun inhibitors gestéiert, an et kann richteg absolute Quantifikatioun ouni Standard Produiten erreechen, déi e Fuerschung an Applikatioun Hotspot gouf.

Geméiss de verschiddene Forme vun der Reaktiounseenheet kann se an dräi Haaptarten opgedeelt ginn: Mikrofluid, Chip an Drëpssystemer.

1) Mikrofluid digital PCR, mdPCR:

Baséierend op der mikrofluidescher Technologie gëtt d'DNA Schabloun getrennt.D'mikrofluidic Technologie kann d'Probe Nano-Upgrade oder d'Generatioun vu méi klengen Drëpsen realiséieren, awer d'Drëpsen brauchen eng speziell Adsorptiounsmethod an dann kombinéiert mat dem PCR Reaktiounssystem.mdPCR gouf no an no duerch aner Methoden ersat adoptéiert.

2) Droplet-baséiert digital PCR, ddPCR:

Benotzt Waasser-an-Ueleg Drëpsen Generatioun Technologie fir d'Probe an Drëpsen ze veraarbechten, an deelt de Reaktiounssystem mat Nukleinsäuremoleküle an Dausende vun Nanoskala Drëpsen, déi jidderee net d'Nukleinsäurezielmolekül enthält fir z'entdecken, oder Enthält een bis e puer Nukleinsäurezielmoleküle fir ze testen.

3) Chip-baséiert digital PCR, cdPCR:

Benotzt d'integréiert Flëssegbunnstechnologie fir vill Mikrotubes a Mikrokavitéiten op Siliziumwafers oder Quarzglas ze gravéieren, a kontrolléiert de Floss vun der Léisung duerch verschidde Kontrollventile, a trennt d'Probeflëssegkeet an Nanometer vun der selwechter Gréisst an d'Reaktiounswellen fir digital PCR Reaktioun fir absolute Quantifikatioun z'erreechen.

D'Haaptnodeeler vun der drëtter Generatioun PCR:

D'Ausrüstung an d'Reagenz sinn deier.

D'Schabloun Qualitéit Ufuerderunge sinn héich.Wann d'Schabloun Quantitéit d'Mikrosystem Quantitéit iwwerschreift, ass et onméiglech ze quantifizéieren, a wann et ze kleng ass, gëtt d'Quantifizéierungsgenauegkeet reduzéiert.

Falsch Positiver kënnen och generéiert ginn wann et net spezifesch Amplifikatioun gëtt.