COVID-19 ass eng ustiechend Krankheet verursaacht vum schwéieren akuten respiratoresche Syndrom Coronavirus Typ 2. Wann eng Persoun infizéiert ass, enthalen déi heefegst Symptomer Féiwer, Husten a kuerz Otem.

D'Proben, déi fir Tester benotzt ginn, kënne gesammelt ginn duerch Nasopharyngeal Swabs oder Oropharyngeal Swabs.

Wat ass PCR?

D'Standardmethod fir Coronavirus Detektioun ass Polymerase Kettenreaktioun, PCR.Dëst ass eng Method déi wäit an der molekulare Biologie benotzt gëtt.Et ka séier Millioune bis Milliarden spezifesch DNA Fragmenter kopéieren.

Den neie Coronavirus enthält e ganz laangen eenzegstrengegen RNA Genom.Fir dës Virussen duerch PCR z'entdecken, mussen RNA Moleküle an hir komplementär DNA Sequenzen ëmgewandelt ginn duerch ëmgedréint Transkriptase, an da kann déi nei synthetiséiert DNA duerch Standard PCR Prozeduren verstäerkt ginn, déi allgemeng als RT-PCR bekannt ass.

RT-PCR Prozess

RNA Extraktioun

Fir dës Method auszeféieren, sollt viral RNA am Fong extrahéiert ginn.Eng Vielfalt vun RNA Purification Kits kënne benotzt ginn fir bequem, séier an effektiv Trennung.

Fir viral RNA mat engem kommerziellen Kit ze extrahieren, füügt d'Probe fir d'éischt an e Mikrocentrifuge-Röhre a vermëscht et dann mam Lysis-Puffer.Dëse Puffer ass héich denaturéiert a besteet normalerweis aus Phenol a Guanidin Isothiocyanat.Zousätzlech sinn RNase Inhibitoren normalerweis am Lysisbuffer präsent fir Isolatioun vun intakt viral RNA ze garantéieren.

Nodeems Dir de Lysis-Puffer bäigefüügt hutt, d'Vermëschungsröhre mat Puls vortexéieren a bei Raumtemperatur inkubéieren.De Virus gëtt dann ënner héich denaturéierende Bedéngungen, déi vum Lysisbuffer geliwwert gëtt, lyséiert.

Nodeems d'Probe lyséiert ass, gëtt en Zentrifugeröhre fir d'Reinigungsprozedur benotzt.D'Probe gëtt an d'Zentrifugeröhre gelueden an dann centrifugéiert.

Dës Prozedur ass eng zolidd Phase Extraktiounsmethod an där déi stationär Phase aus enger Silikagel Matrix besteet.

Ënner optimale Salz- a pH-Konditioune binden d'RNA-Moleküle un d'Silika-Membran.

Zur selwechter Zäit ginn Protein an aner Verschmotzunge geläscht.

No der Zentrifugerung, setzt d'Zentrifugerröhre an e proppert Sammelröhre, entlooss de Filtrat, a füügt dann Wäschbuffer derbäi.

Setzt d'Röhre erëm an d'Zentrifuge fir de Wäschbuffer duerch d'Membran ze zwéngen.Dëst wäert all verbleiwen Gëftstoffer aus der Membran ewechhuelen, a léisst nëmmen d'RNA un de Silikagel gebonnen.

Nodeems d'Probe gewäsch ass, setzt d'Röhre an e proppert Mikrocentrifuge-Röhre a füügt den Elutiounsbuffer derbäi.

Et gëtt dann centrifugéiert fir den Elutiounsbuffer duerch d'Membran ze zwéngen.Den Elutiounsbuffer läscht viral RNA aus der Spin-Kolonn a kritt gereinegt RNA fräi vu Proteinen, Inhibitoren an aner Kontaminanten.

SCHRËTT 2

Gemëscht Konzentratioun

Nom Extrait vun der viraler RNA ass de nächste Schrëtt d'Reaktiounsmëschung fir PCR Amplifikatioun virzebereeden.An dësem Schrëtt gëtt Konzentrat benotzt.Dës konzentréiert Léisung ass eng virgemëschte konzentréiert Léisung besteet aus engem Premix, ëmgedréint Transkriptase, Nukleotiden, Forward Primer, Reverse Primer, TaqMan Sonde an DNA Polymerase.

Schlussendlech, fir dës Reaktiounsmëschung ze kompletéieren, gëtt d'RNA Schabloun bäigefüügt.D'Réier ginn duerch Pulsvortexing gemëscht, an dann gëtt d'Reaktiounsmëschung an d'PCR Plack gelueden.D'PCR Plack enthält normalerweis 96 Wells a ka verschidde Proben zur selwechter Zäit analyséieren.

SCHRËTT 3

PCR Amplifikatioun

Als nächst setzt d'Plack an der PCR Maschinn, déi am Wesentlechen en thermesche Cycler ass.

Echtzäit RT-PCR gëtt benotzt fir den 2019 Roman Coronavirus z'entdecken andeems d'Zielsequenz am RdrRP Gen, E Gen an N Gen amplifizéiert gëtt.D'Wiel vum Zilgen hänkt vun der Primer an der Sondesequenz of.

Den éischte Schrëtt vun RT-PCR ass ëmgedréint Transkriptioun.Den éischte Strang vun der komplementärer DNA gëtt synthetiséiert, wat initiéiert gëtt vum PCR Reverse Primer, deen un de komplementären Deel vum virale RNA Genom bindet.Duerno füügt ëmgedréint Transkriptase DNA Nukleotiden un den 3'Enn vum Primer derbäi fir DNA komplementär zum virale RNA ze synthetiséieren.D'Temperatur an d'Dauer vun dësem Schrëtt hänkt vun de benotzte Primer, Zil-RNA a Reverse Transkriptase of.

Als nächst gëtt en initialen Denaturatiounsschrëtt applizéiert, wat zu der Denaturatioun vum RNA-DNA Hybrid resultéiert.Dëse Schrëtt ass néideg fir d'DNA Polymerase z'aktivéieren.Zur selwechter Zäit gëtt ëmgedréint Transkriptase inaktivéiert.

PCR besteet aus enger Serie vun thermesche Zyklen.All Zyklus besteet aus Denaturatioun, annealing an Extensioun Schrëtt.

Den Denaturatiounsschrëtt beinhalt d'Erhëtzung vun der Reaktiounskammer op 95 Grad Celsius a benotzt se fir d'Denaturatioun vun der duebelstrengend DNA Schabloun.

Am nächste Schrëtt gëtt d'Reaktiounstemperatur op 58 Grad Celsius reduzéiert, wat de Forward Primer erlaabt un de komplementären Deel vu senger eenzegstrengegen DNA Schabloun ze anneal.D'Annealtemperatur hänkt direkt vun der Längt an der Zesummesetzung vum Primer of.

Am Extensiounsschrëtt synthetiséiert d'DNA-Polymerase en neien DNA-Strang deen komplementär zum DNA-Schablounstrang ass.Andeems Dir gratis Käre ergänzt fir d'Schabloun an der 5'bis 3'Richtung vun der Reaktiounsmëschung.D'Temperatur vun dësem Schrëtt hänkt vun der benotzter DNA Polymerase of.

Nom éischten Zyklus gëtt en duebelstrengend DNA Zil kritt.

Da gitt an den zweeten Zyklus.Déi duebelstrengeg DNA gëtt denaturéiert fir zwee eenzegstrengeg DNA Moleküle ze produzéieren.

Am nächste Schrëtt gëtt d'Reaktiounstemperatur erofgesat, d'Primer ginn op all eenzel-strenged DNA Schabloun annealéiert, an d'Taq-man Sonde gëtt un de komplementären Deel vun der Zil-DNA annealéiert.

D'TaqMan-Sond besteet aus engem Fluorophore kovalent verbonne mat dem 5'Enn vun der Oligonukleotid-Sond.Wann d'Liichtquell vum Cycler opgereegt gëtt, emittéiert de Fluorophore Fluoreszenz.Ausserdeem besteet d'Sond aus engem Quencher um 3'Enn.D'Proximitéit vum Reportergen zum Quencher verhënnert d'Detektioun vu Fluoreszenz.

Am Extensiounsschrëtt synthetiséiert d'DNA Polymerase en neie Strang.Wann d'Polymerase d'TaqMan Sonde erreecht, spalt seng endogen 5'Nuklease Aktivitéit d'Sond, trennt de Faarfstoff vum Quencher.

Mat all Zyklus vu PCR gi méi Faarfmoleküle fräigelooss, wat zu enger Erhéijung vun der Fluoreszenzintensitéit proportional zu der Unzuel vun synthetiséierte Amplikonen resultéiert.

Dës Method erlaabt d'Zuel vun enger bestëmmter Sequenz präsent an der Probe ze schätzen.D'Zuel vun duebelstrengegen DNA Fragmenter verduebelt sech an all Zyklus.Dofir kann PCR benotzt ginn fir ganz kleng Proben ze analyséieren.

Fir Miessunge Leuchtstoff Signal, Wolfram Halogenlampe, excitation FILTER, Reflektor, Lens, Emissioun FILTER an charge gekoppelter Apparat benotzt CCD Kamera.

SCHRËTT 4 Detektéieren

Fir Miessunge Leuchtstoff Signal, Wolfram Halogenlampe, excitation FILTER, Reflektor, Lens, Emissioun FILTER an charge gekoppelter Apparat benotzt CCD Kamera.

Dat gefiltert Liicht vun der Lampe gëtt vum Reflektor reflektéiert, passéiert duerch d'Kondensatorlens a fokusséiert an d'Mëtt vun all Lach.Da gëtt d'Fluoreszenz aus dem Lach aus dem Spigel reflektéiert, passéiert duerch den Emissiounsfilter a gëtt vun der CCD Kamera festgestallt.An all PCR-Zyklus kann d'selbstbegeeschtert Fluorophoreliicht vun der CCD festgestallt ginn.

Et konvertéiert dat erfaasst Liicht an digital Daten.Dës Method gëtt Echtzäit PCR genannt, an et erlaabt Echtzäit Iwwerwaachung vum Fortschrëtt vun der PCR Reaktioun.