Jiddereen schwätzt iwwer de Prinzip vum qRT-PCR Experiment, Primer Design, Resultatinterpretatioun, etc., awer ech mengen, ech sollt mat Iech d'experimentell Operatioun vun qRT-PCR deelen.Et ass kleng, awer et geet ëm d'Resultater.
Ier Dir qRT-PCR maachen, musse mir e kloert Verständnis vun eisen eegene RNS an Operatiounsmethoden hunn.No allem sinn eis Efforte fir Resultater z'erreechen, anstatt einfach ze üben.Also ier mir qRT-PCR maachen, musse mir déi folgend Themen bestëmmen (e puer vun deenen sinn nëmme fir SYBR applicabel).
1 Sidd Dir sécher datt Är RNA net degradéiert ass?
NanoDrop 2000 kann nëmmen d'Konzentratioun an Rengheet vun RNA z'entdecken, awer kann net d'Integritéit vun RNA entdecken.
Den RNA (RNA Intesity Number) Wäert kann d'Integritéit vun der RNA reflektéieren, déi vum Agilent 2100 Bioanalyzer System festgestallt gëtt.
Fig Schematesch Diagramm vun RIN Wäerter fir verschidde RNA Echantillon (Eukaryoten)
Wéi och ëmmer, Laboratoiren hunn allgemeng keen Agilent 2100 Bioanalyzer.An dësem Fall kënne mir duerch Formaldehydgel entdecken, awer d'Ufuerderung fir de Gesamtbetrag vun der RNA ass héich, also ass déi schnellst Method fir gewéinlech Gelelektrophorese ze benotzen.Et ass erfuerderlech an engem nukleasefräien Ëmfeld ze sinn, also ass et néideg fir den Elektrophoresetank, d'Solfläsch, d'Gel-Klammern a Kamm mat DEPC Waasser ze spülen.D'Agarose ass och nukleasefräi (soulaang se frësch opgemaach ass), an de Loading Buffer soll sou vill wéi méiglech frësch opgemaach ginn, mat 1,2% Gel.
Bedenkt datt de Gel komplett opgeléist muss ginn, soss wäert et inhomogene Bands verursaachen, wéi an der Probe 9 an der Figur.Wann d'Spannung ze héich ass oder ze laang leeft, wäert d'Hëtzt generéieren an d'RNA-Degradatioun verursaachen, sou datt d'Spannung an d'Zäit raisonnabel kontrolléiert ginn.Zousätzlech, kann gel Lafen och weider bestëmmen ob et DNA Reschter an der Prouf ass, an beobachten ob et eng grouss Zuel vun erhalener Bands am dispensing gutt sinn.
Figur.Gel Elektrophorese Detektioun vu RNA
2 Sidd Dir sécher iwwer d'Konzentratioun vun Ärem cDNA?
D'Erfahrung vun de grousse Bridder am Labo ass datt d'cDNA vum 20 ul System, deen duerch all Inversioun kritt gëtt, direkt 20X verdünnt ass, während d'postdoktoresch Schwësteren 10X verdünnt sinn.Ech hänken normalerweis vun der Situatioun of.Well d'Qualitéit vun der RNA vun all Persoun erwähnt ass anescht, ass den Niveau vum Réckgang och anescht, an d'Reversaltechnologie ass vläicht net stabil.
Also all Kéier wann ech de ëmgedréint cDNA kréien, wäert ech et fir d'éischt ongeféier 3 Mol verdünnen, an dann den Haushaltsgen benotzen fir RT-PCR ze maachen, d'Zuel vun den Zyklen ass allgemeng 25 Zyklen, fir déi spezifesch Konzentratioun z'identifizéieren, an dann de finalen Verdünnungsfaktor bestëmmen.
3 Sidd Dir sécher datt Är Primer einfach ze benotzen sinn?
Et kann d'Schmelzkurve vu qRT-PCR passéieren, awer dëst kascht ëmmer nach Sue.Fir Laboratoiren ouni vill Suen, wann se vill Primer kréien, kënne se gewéinlech RT-PCR benotzen fir ze kucken ob et eng eenzeg Band ass an d'Spezifizitéit vun de Primer z'identifizéieren.Wann de Laboratoire net vu Suen knapp ass, kann d'Spezifizitéit vun all Primer eemol duerch d'Schmelzkurve identifizéiert ginn.
4 Sidd Dir sécher datt Är experimentell Konditioune gëeegent sinn?
SYBR soll aus staark Luucht geschützt ginn, also probéiert d'Overhead Luucht auszeschalten wann SYBR Reagens dobäi, a brauch nëmmen däischter Luucht ze benotzen et komplett.
Store SYBR bei 4 ° C.Wann Dir benotzt, sanft op an erof ëmdréinen fir gutt ze vermëschen fir Schaum ze vermeiden, an net kräfteg vortexéieren.
E puer méi jonk Schwësteren hu gär Marken op der PCR Board ze zéien aus Angscht d'Proben ze vermëschen, wat falsch ass.Well Är Markéierer ganz wahrscheinlech d'Sammlung vu fluoreszent Signaler beaflossen, recommandéieren ech allgemeng Junioren experimentell Notizbicher ze benotzen fir an der Erënnerung ze hëllefen, wéi hei ënnendrënner.
Figur.qRT-PCR Probe Luede Diagramm
5 Sidd Dir sécher datt Dir et richteg maacht?
Gitt sécher Handschuesch unzedoen, Handschuesch ze droen, Handschuesch unzedoen a wichteg Saachen dräimol ze soen.
Fir d'Beliichtung vum SYBR op d'Liicht ze reduzéieren, ginn ech perséinlech gär fir d'éischt e Schabloun derbäi, wéi an der Figur hei drënner.Laut Erfarung ass d'Zousatz vun enger klenger Quantitéit Schabloun méiglecherweis Probefehler.Dofir, fir de Feeler ze minimiséieren, deen duerch eng kleng Quantitéit vun der Schabloun bäigefüügt gëtt, verduebelen ech normalerweis d'Probe erëm, an duebel de Betrag wann Dir d'Probe bäidréit fir d'Quantitéit vun H2O2 derbäi ze reduzéieren.
Figur.Schematesch Diagramm vun qRT-PCR Luede
Da konfiguréiert de qRT-PCR System wéi follegt.
Figur.qRT-PCR System Virbereedung Diagramm
NOTÉIERT: De Konfiguratiounsprozess muss op Äis gemaach ginn.
Nodeems Dir d'Probe bäigefüügt hutt, paste de transparenten Dichtungsfilm.Probéiert net d'Uewerfläch vum transparenten Dichtungsfilm mat Ären Hänn ze beréieren, just aus dem Raum op béide Säiten vum Film operéieren.Well Fangerofdréck kënnen och d'Sammlung vu fluoreszent Signaler beaflossen.Benotzt dann eng Zentrifuge fir séier 10 Sekonnen op niddereger Geschwindegkeet ze centrifugéieren fir ze verhënneren datt d'Probe op der Mauer hänkt.
Zesummenhang Produkter:
Post Zäit: Apr-28-2023
