Iwwersiicht
Rapid Identifikatioun vun transgene Planzen
Text / Tong Yucheng
Experimentell Operatioun / Han Ying
Editor / Wen Youjun
Wierder / 1600+
Virgeschloe Lieszäit / 8-10 Minutten
Rapid Identifikatioun vun transgene Planzen
Als Newcomer am Laboratoire ass et net eng gutt Aarbecht fir positiv Planzen aus enger Rëtsch Planzen mat engem nidderegen Ëmrechnungsquote ze screenen.Als éischt muss DNA aus enger grousser Zuel vu Proben een nom aneren extrahéiert ginn, an da ginn déi auslännesch Genen duerch PCR festgestallt.Wéi och ëmmer, d'Resultater sinn dacks eidel a Bands mat e puer Elementer heiansdo, awer et ass onméiglech ze bestëmmen ob et verpasst Detectiounen oder falsch Detectiounen sinn..Ass et ganz hëlleflos esou experimentell Prozess a Resultater ze konfrontéieren?Maacht Iech keng Suergen, Brudder léiert Iech wéi Dir transgen positiv Planzen einfach a präzis ausschirft.
Schrëtt 1: Design Detektioun Primer
Bestëmmt den endogene Gen an den exogenen Gen, deen no der Probe festgestallt gëtt, déi getest gëtt, a wielt eng representativ 100-500bp Sequenz am Gen fir Primer Design.Gutt Primer kënnen d'Genauegkeet vun den Detektiounsresultater garantéieren an d'Detektiounszäit verkierzen (kuckt den Appendix fir allgemeng benotzt Detektiounsprimer).
Notiz:
Déi nei entworf Primer mussen d'Reaktiounsbedéngungen optimiséieren an d'Genauegkeet, Präzisioun an d'Detektiounsgrenz vun der Detektioun verifizéieren ier se grouss-Skala Detektioun ausféieren.
Schrëtt 2:Entwéckelt experimentell Protokoll
Positiv Kontroll: Benotzt déi gereinegt DNA mat dem Zilfragment als Schabloun fir ze bestëmmen ob de PCR Reaktiounssystem a Konditioune normal sinn.
Negativ / eidel Kontroll: Benotzt eng DNA Schabloun oder ddH2O dat enthält net den Zilfragment als Schabloun fir z'entdecken ob et eng Quell vu Kontaminatioun am PCR System ass.
Intern Referenzkontrolle: Benotzt d'Primer / Sonde Kombinatioun vum endogene Gen vun der Probe fir ze testen fir ze evaluéieren ob d'Schabloun duerch PCR erkannt ka ginn.
Notiz:
Positiv, negativ / eidel Kontrollen an intern Kontrollkontrolle solle fir all Test gesat ginn fir d'Validitéit vun den experimentellen Resultater ze evaluéieren.
Schrëtt 3: Experiment Virbereedung
Virum Gebrauch, beobachtet ob d'Léisung gläichméisseg gemëscht ass.Wann Nidderschlag fonnt gëtt, muss et opgeléist a gemëscht ginn no den Instruktioune virum Gebrauch.2 × PCR Mëschung muss pipetteiert a widderholl mat enger Mikropipette virum Gebrauch gemëscht ginn fir ongläiche Ionenverdeelung ze vermeiden.
Notiz:
Huelt d'Instruktioune eraus a liest se suergfälteg a maacht Virbereedunge virum Experiment strikt am Aklang mat den Instruktiounen.
Schrëtt 4: Preparéieren PCR Reaktioun System
Geméiss dem experimentellen Protokoll, mixen d'Primeren, H2O, 2 × PCR Mëschung, centrifugéiert a verdeelt se op all Reaktiounsröhre.
Notiz:
Fir grouss Skala oder laangfristeg Tester ass et recommandéiert e PCR Reaktiounssystem ze benotzen deen UNG Enzym enthält, wat effektiv Aerosolkontaminatioun verursaacht duerch PCR Produkter vermeide kann.
Schrëtt 5: Reaktiounsschabloun derbäi
Mat Direct PCR Technologie ass et kee Besoin fir langweileg Nukleinsäure Reinigungsprozess.D'Probe Schabloun ka bannent 10 Minutte virbereet ginn an an de entspriechende PCR Reaktiounssystem bäigefüügt.
Notiz:
D'Lysis-Methode huet e besseren Detektiounseffekt, an dat kritt Produkt ka fir verschidde Detektiounsreaktiounen benotzt ginn.
5.1: Direkt PCR vun Blieder
Laut der Gréisst vum Bild am Handbuch, schneiden d'Blatgewebe mat engem Duerchmiesser vun 2-3mm a setzen se an de PCR-Reaktiounssystem.
Bemierkung: Vergewëssert Iech datt d'Blatfragmenter komplett an der PCR Reaktiounsléisung ënnerdaucht sinn, a fügen net exzessiv Blatgewebe derbäi.
5.2: Leaf lysis Method
Schneid d'Blatgewebe mat engem Duerchmiesser vu 5-7mm a setzt se an engem Zentrifugeröhre.Wann Dir reife Blieder wielt, vermeit w.e.g. d'Gewëss vun der Haaptvene vum Blat ze benotzen.Pipette 50ul Buffer P1 Lysat an en Zentrifuge Röhre fir sécherzestellen datt d'Lysat d'Blatgewebe komplett taucht ka ginn, plazéiert et an engem thermesche Cycler oder e Metallbad, a lyséiert bei 95 ° C fir 5-10 Minutten.
Füügt 50ul Buffer P2 Neutraliséierungsléisung a mëschen gutt.Dat resultéierend Lysat kann als Schabloun benotzt ginn an zum PCR Reaktiounssystem bäigefüügt ginn.
Bemierkung: De Betrag vun der Schabloun soll tëscht 5-10% vum PCR-System sinn, a sollt net méi wéi 20% sinn (zum Beispill, an engem 20μl PCR-System, addéiere 1-2μl Lysisbuffer, net méi wéi 4μl).
Schrëtt 6: PCR Reaktioun
Nodeems Dir de PCR Reaktiounsröhre centrifugéiert, setzt se an engem PCR-Instrument fir d'Verstäerkung.
Notiz:
D'Reaktioun benotzt net gereinegt Template fir Amplifikatioun, sou datt d'Zuel vun den Amplifikatiounszyklen 5-10 méi Zyklen ass wéi wann Dir gereinegt DNA Template benotzt.
Schrëtt 7: Elektrophoresis Detektioun a Resultatanalyse
M:100bp DNA Leeder
1 \ 4: Purifizéiert DNA Method
2\5: Direkt PCR Method
3\6: Blank Kontroll
Qualitéitskontroll:
D'Testresultater vun de verschiddene Kontrollen, déi am Experiment festgeluecht goufen, sollten déi folgend Konditiounen erfëllen.Soss soll d'Ursaach vum Problem analyséiert ginn, an den Test soll erëm gemaach ginn nodeems de Problem eliminéiert ass.
Table 1. Normal Testresultater vu verschiddene Kontrollgruppen
* Wann de Plasmid als positiv Kontroll benotzt gëtt, kann dat endogene Gentestresultat negativ sinn
Resultat Uerteel:
A. D'Testresultat vum endogene Gen vun der Probe ass negativ, wat beweist datt d'DNA gëeegent fir gewéinlech PCR Detektioun net aus der Probe extrahéiert ka ginn oder d'extraktéiert DNA enthält PCR Reaktiounsinhibitoren, an d'DNA soll erëm extrahéiert ginn.
B. D'Testresultat vum endogene Gen vun der Probe ass positiv, an d'Testresultat vum exogenen Gen ass negativ, wat beweist datt d'DNA gëeegent fir gewéinlech PCR Detektioun aus der Probe extrahéiert gëtt, an et kann beurteelt ginn datt den XXX Gen net an der Probe festgestallt gëtt.
C. D'Testresultat vum endogene Gen vun der Probe ass positiv, an d'Testresultat vum exogenen Gen ass positiv, wat beweist datt d'DNA gëeegent fir gewéinlech PCR Detektioun aus der Probe extrahéiert gouf, an d'Probe DNA enthält den XXX Gen.Bestätegungsexperimenter kënne weider duerchgefouert ginn.
Schrëtt 8: Design Detectioun primers
Nom Experiment benotzt 2% Natriumhypochlorit-Léisung an 70% Ethanol-Léisung fir d'Experimentalgebitt ze wëschen fir d'Ëmweltverschmotzung ze vermeiden.
Anhang
Table 2. Allgemeng benotzt Primer fir allgemeng PCR Detektioun vu genetesch modifizéierten Planzen
Referenzdokument:
SN/T 1202-2010, Qualitativ PCR Detektiounsmethod fir genetesch modifizéiert Planz Zutaten a Liewensmëttel.
Landwirtschaftsministère Ukënnegung 1485-5-2010, Testen vun den Zutaten vun genetesch modifizéierten Planzen an hir Produkter - Reis M12 a seng Derivate.
Post Zäit: Jun-09-2021
