1. Grondkenntnisser (wann Dir den experimentellen Deel wëllt gesinn, gitt w.e.g. direkt op den zweeten Deel)
Als derivative Reaktioun vu konventionelle PCR iwwerwaacht Echtzäit PCR haaptsächlech d'Ännerung vum Betrag vum Amplifikatiounsprodukt an all Zyklus vun der PCR Amplifikatiounsreaktioun an Echtzäit duerch d'Verännerung vum Fluoreszenzsignal, a quantitativ analyséiert d'Startschabloun duerch d'Relatioun tëscht dem ct Wäert an der Standardkurve.
Déi spezifesch Donnéeën vun RT-PCR sinnbaseline, FluoreszenzschwellanCt Wäert.
| baseline: | De Fluoreszenzwäert vum 3.-15. Zyklus ass d'Basislinn (Basislinn), déi duerch de gelegentleche Feeler vun der Messung verursaacht gëtt. |
| Threshold (Schwell): | bezitt sech op d'Fluoreszenz Detektiounslimit, déi op enger entspriechender Positioun an der exponentieller Wuesstumsregioun vun der Amplifikatiounskurve festgeluecht ass, allgemeng 10 Mol d'Standardabweichung vun der Basislinn. |
| CT Wäert: | Et ass d'Zuel vun de PCR Zyklen wann de Fluoreszenzwäert an all Reaktiounsröhre d'Schwell erreecht. De Ct Wäert ass ëmgedréint proportional zum Betrag vun der initialer Schabloun. |
Gemeinsam Etikettéierungsmethoden fir RT-PCR:
| Method | Virdeel | Mängel | Ëmfang vun Applikatioun |
| SYBR GréngⅠ | Breet Applikatioun, sensibel, bëlleg a praktesch | Primer Ufuerderunge sinn héich, ufälleg fir net spezifesch Bands | Et ass gëeegent fir quantitativ Analyse vu verschiddenen Zilgenen, Fuerschung iwwer Genausdrock, a Fuerschung iwwer transgen rekombinant Déieren a Planzen. |
| TaqMan | Gutt Spezifizitéit an héich Wiederholbarkeet | De Präis ass héich an nëmme gëeegent fir spezifesch Ziler. | Pathogenerkennung, Drogenresistenz Genfuerschung, Medikamenter Effizienz Bewäertung, Diagnostik vu genetesche Krankheeten. |
| molekulare Beacon | Héich Spezifizitéit, Fluoreszenz, nidderegen Hannergrond | De Präis ass héich, et ass nëmme gëeegent fir e spezifeschen Zweck, den Design ass schwéier, an de Präis ass héich. | Spezifesch Genanalyse, SNP Analyse |
2. Experimentell Schrëtt
2.1 Iwwer d'experimentell Gruppéierung- et musse méi Brunnen am Grupp sinn, an et muss biologesch Widderhuelunge sinn.
| ① | Blank Kontroll | Benotzt fir Zellwachstumsstatus an Experimenter z'entdecken |
| ② | Negativ Kontroll siRNA (net spezifesch siRNA Sequenz) | Demonstréiert d'Spezifizitéit vun der RNAi Handlung.siRNA kann net spezifesch Stressreaktioun bei enger Konzentratioun vun 200nM induzéieren. |
| ③ | Transfektiounsreagens Kontroll | Ausgeschloss d'Toxizitéit vum Transfektionsreagens op d'Zellen oder den Effekt op den Ausdrock vum Zilgen |
| ④ | siRNA géint Zilgen | Klappt den Ausdrock vum Zilgen erof |
| ⑤ (optional) | positiv siRNA | Benotzt fir experimentell System an operationell Probleemer ze léisen |
| ⑥ (optional) | Fluorescent Kontroll siRNA | D'Effizienz vun der Zelltransfektioun kann mat engem Mikroskop observéiert ginn |
2.2 Prinzipien vun primer Design
| Amplifizéiert Fragmentgréisst | Am léifsten bei 100-150bp |
| Primer Längt | 18-25 bp |
| GC Inhalt | 30% -70%, am léifsten 45% -55% |
| Tm Wäert | 58-60 ℃ |
| Sequenz | Vermeiden T / C kontinuéierlech;A/G kontinuéierlech |
| 3 Enn Sequenz | Vermeiden GC räich oder AT räich;d'Terminalbasis ass am léifsten G oder C;et ass am beschten T ze vermeiden |
| Komplementaritéit | Vermeit komplementär Sequenze vu méi wéi 3 Basen am Primer oder tëscht zwee Primer |
| Spezifizitéit | Benotzt Blast Sich fir Primer Spezifizitéit ze bestätegen |
①SiRNA ass Speziesspezifesch, an d'Sequenze vu verschiddenen Arten wäerten ënnerschiddlech sinn.
②SiRNA ass a gefruergetrockene Pudder verpackt, wat stabil fir 2-4 Wochen bei Raumtemperatur gelagert ka ginn.
2.3 Tools oder Reagenz, déi am Viraus virbereet musse ginn
| Primer (intern Referenz) | Dorënner vir an ëmgedréint zwee |
| Primer (Zielgen) | Dorënner vir an ëmgedréint zwee |
| Target Si RNA (3 Sträifen) | Allgemeng synthetiséiert d'Firma 3 Sträifen, a wielt dann ee vun deenen dräi duerch RT-PCR |
| Transfektiounen Kit | Lipo2000 etc. |
| RNA Rapid Extraktioun Kit | Fir RNA Extraktioun no Transfektioun |
| Rapid Reverse Transcription Kit | fir cDNA Synthese |
| PCR Amplifikatioun Kit | 2× Super SYBR Gréng qPCR Master Mix |
2.4 Wat d'Themen ugeet, op déi an de spezifesche experimentelle Schrëtt opgepasst musse ginn:
①siRNA Transfektiounsprozess
1. Fir Plating, kënnt Dir 24-Well Plack, 12-Well Plack oder 6-Well Plack wielen (déi duerchschnëttlech RNA Konzentratioun proposéiert an all Well vun enger 24-Well Plack ass ongeféier 100-300 ng /uL), an déi optimal Transfektiounsdicht vun Zellen ass bis zu 60% -80% oder sou
2. D'Transfektiounsschrëtt a spezifesch Ufuerderunge si strikt am Aklang mat den Instruktiounen.
3. No der Transfektioun kënne Proben bannent 24-72 Stonnen gesammelt ginn fir mRNA Detektioun (RT-PCR) oder Proteinerkennung bannent 48-96 Stonnen (WB)
② RNA Extraktiounsprozess
1. Verhënnert Kontaminatioun vun exogenen Enzymen.Et ëmfaasst haaptsächlech Droen Masken a Handschuesch streng;benotzt steriliséierte Pipette Tipps an EP Tubes;d'Waasser am Experiment benotzt muss RNase-Free sinn.
2. Et ass recommandéiert zweemol ze maachen wéi am Quick Extraktioun Kit proposéiert, wat d'Rengheet an d'Ausbezuele wierklech verbessert.
3. D'Offallflëssegkeet däerf d'RNA Kolonn net beréieren.
③ RNA Quantifikatioun
Nodeems d'RNA extrahéiert ass, kann se direkt mat Nanodrop quantifizéiert ginn, an d'Mindestliesung kann esou niddereg wéi 10ng / ul sinn.
④ Reverse Transkriptiounsprozess
1. Wéinst der héijer Empfindlechkeet vun RT-qPCR, sollen op d'mannst 3 parallel Wells fir all Prouf gemaach ginn, fir de spéider Ct ze verhënneren aus ze anescht oder d'SD ze grouss fir statistesch Analyse.
2. Net afréieren an Thaw Master Mix ëmmer erëm.
3. All Rouer/Lach muss mat engem neien Tipp ersat ginn!Benotzt net kontinuéierlech dee selwechte Pipette Tipp fir Proben ze addéieren!
4. De Film, deen op d'96-Well Plack befestegt ass, nodeems d'Probe bäigefüügt ass, muss mat enger Plack glätt ginn.Et ass am beschten ze centrifugéieren ier se op d'Maschinn setzen, sou datt d'Flëssegkeet op der Rouermauer erof fléien an d'Loftblasen erofhuelen.
⑤ Gemeinsam Kurve Analyse
| Keng Period vu logarithmesche Wuesstum | Méiglech héich Konzentratioun vun Schabloun |
| Keen CT Wäert | Falsch Schrëtt fir d'Erkennung vun fluoreszent Signaler; Degradatioun vu Primer oder Sonden - seng Integritéit kann duerch PAGE Elektrophorese festgestallt ginn; net genuch Betrag vun der Schabloun; Degradatioun vu Schablounen - Vermeiden vun der Aféierung vun Gëftstoffer a widderholl Afréiere a Verdauen an der Probepräparatioun; |
| Ct>38 | Niddereg Verstäerkungseffizienz;PCR Produkt ass ze laang;verschidde Reaktiounskomponenten ginn ofgebaut |
| Linear Verstäerkungskurve | Sonde kënnen deelweis degradéiert ginn duerch widderholl Gefrier-Tau-Zyklen oder verlängerter Belaaschtung u Liicht |
| Den Ënnerscheed an duplizéiert Lächer ass besonnesch grouss | D'Reaktiounsléisung ass net komplett geschmollt oder d'Reaktiounsléisung ass net gemëscht;d'Thermalbad vum PCR-Instrument ass kontaminéiert vu fluoreszente Substanzen |
2.5 Iwwer Donnéeën Analyse
D'Datenanalyse vu qPCR kann a relativ Quantifikatioun an absolut Quantifikatioun opgedeelt ginn.Zum Beispill, Zellen an der Behandlung Grupp am Verglach mat Zellen an der Kontroll Grupp,
Wéi oft ännert d'mRNA vum X Gen, dat ass eng relativ Quantifikatioun;an enger bestëmmter Zuel vun Zellen, d'mRNA vum X Gen
Wéi vill Exemplare ginn et, dat ass absolute Quantifikatioun.Normalerweis wat mir am meeschten am Labo benotzen ass déi relativ quantitativ Method.Normalerweis,2-ΔΔct Methodgëtt am meeschten an Experimenter benotzt, sou datt nëmmen dës Method hei am Detail agefouert gëtt.
2-ΔΔct Method: D'Resultat kritt ass den Ënnerscheed am Ausdrock vum Zilgen an der experimenteller Grupp relativ zum Zilgen an der Kontrollgruppe.Et ass erfuerderlech datt d'Verstäerkungseffizienz vum Zilgen an dem internen Referenzgen no bei 100% sinn, an d'relativ Ofwäichung däerf net méi wéi 5% sinn.
D'Berechnungsmethod ass wéi follegt:
Δct Kontrollgruppe = ct Wäert vum Zilgen an der Kontrollgruppe - ct Wäert vum internen Referenzgen an der Kontrollgruppe
Δct experimentell Grupp = ct Wäert vum Zilgen an der experimenteller Grupp - ct Wäert vum internen Referenzgen an der experimenteller Grupp
ΔΔct=Δct experimentell Grupp-Δct Kontrollgruppe
Endlech berechent d'Multiple vum Ënnerscheed am Ausdrockniveau:
Change Fold = 2-ΔΔct (entspriechend der Excel Funktioun ass POWER)
Zesummenhang Produkter:
Post Zäit: Mee-20-2023
