• PCR ass eng Method déi benotzt gëtt fir DNA aus enger klenger Quantitéit vun DNA Template ze verstäerken.RT-PCR benotzt ëmgedréint Transkriptioun fir eng DNA Schabloun aus enger RNA Quell ze produzéieren déi dann amplifizéiert ka ginn.
• PCR an RT-PCR sinn typesch Endpunktreaktiounen, wärend qPCR an RT-qPCR d'Kinetik vun der Geschwindegkeet vun der Produktsynthese wärend der PCR Reaktioun benotzen fir d'Quantitéit vun der präsent Schabloun ze quantitéieren.
• Méi nei Methoden, wéi digital PCR, liwweren absolute Quantitatioun vun der initialer DNA Schabloun, wärend Methode wéi isothermesch PCR reduzéieren de Besoin fir deier Ausrüstung fir zouverlässeg Resultater ze bidden.

Polymerase Kettenreaktioun (PCR) ass eng relativ einfach a wäit benotzt molekulare Biologie Technik fir DNA an RNA Sequenzen ze verstäerken an z'entdecken.Am Verglach mat traditionelle Methoden fir DNA Klonen an Amplifikatioun, déi dacks Deeg daueren, brauch PCR nëmmen e puer Stonnen.PCR ass héich sensibel a erfuerdert minimal Schabloun fir Detektioun an Amplifikatioun vu spezifesche Sequenzen.Basis PCR Methoden si weider fortgeschratt vun der einfacher DNA a RNA Detektioun.Drënner hu mir en Iwwerbléck iwwer déi verschidde PCR Methoden an d'Reagenser déi mir bei Enzo Life Sciences ubidden fir Är Fuerschungsbedürfnisser.Mir zielen d'Wëssenschaftler séier Zougang zu PCR Reagenzen ze hëllefen fir an hirem nächste Fuerschungsprojet ze benotzen!

PCR

Fir Standard PCR, alles wat Dir braucht ass eng DNA Polymerase, Magnesium, Nukleotiden, Primer, d'DNA Schabloun fir amplifizéiert ze ginn, an en Thermocycler.De PCR Mechanismus ass sou einfach wéi säin Zweck: 1) duebelstrengeg DNA (dsDNA) ass Hëtzt denaturéiert, 2) Primer alignéieren op déi eenzel DNA Strécke, an 3) d'Primer ginn duerch DNA Polymerase verlängert, wat zu zwee Kopien vun der Original DNA Strang.D'Denaturatioun, annealing, an elongation Prozess iwwer eng Serie vun Temperaturen an Zäite ass bekannt als een Zyklus vun amplification (Fig. 1).

All Schrëtt vum Zyklus soll fir d'Schabloun an d'Primer-Set benotzt ginn optimiséiert.Dësen Zyklus gëtt ongeféier 20-40 Mol widderholl, an de verstäerkte Produkt kann dann analyséiert ginn, typesch duerch Agarosegel (Fig. 2).

Well PCR eng héich sensibel Method ass a ganz kleng Volumen fir eenzel Reaktiounen erfuerderlech sinn, ass d'Virbereedung vun engem Mastermix fir verschidde Reaktiounen recommandéiert.D'Mastermix muss gutt gemëscht ginn an dann duerch d'Zuel vun de Reaktiounen opgedeelt ginn, fir datt all Reaktioun déiselwecht Quantitéit un Enzym, dNTPs a Primer enthält.Vill Fournisseuren, wéi Enzo Life Sciences, bidden och PCR Mëschungen, déi schonn alles enthalen ausser Primer an d'DNA Schabloun.

Guanine /Cytosine-räich (GC-räich) Regiounen vertrieden eng Erausfuerderung am Standard PCR Techniken.GC-räich Sequenzen si méi stabil wéi Sequenzen mat nidderegen GC Inhalt.Ausserdeem tendéieren GC-räich Sequenzen fir sekundär Strukturen ze bilden, sou wéi Haarnadelschleifen.Als Resultat, sinn GC-räich duebel strands schwéier während der denaturation Phase komplett ze trennen.Dofir kann DNA Polymerase den neie Strang net ouni Hindernisser synthetiséieren.Eng méi héich Denaturatiounstemperatur kann dëst verbesseren, an Upassunge fir eng méi héije Glühungstemperatur a méi kuerz Glühungszäit kënnen d'onspezifesch Bindung vu GC-räiche Primer verhënneren.Zousätzlech reagents kann d'amplification vun GC-räiche Sequenzen verbesseren.DMSO, Glycerol, a Betain hëllefen déi sekundär Strukturen ze stéieren, déi duerch GC Interaktiounen verursaacht ginn an doduerch d'Trennung vun den Duebelstrengen erliichteren.

Hot Start PCR

Onspezifesch Amplifikatioun ass e Problem deen während PCR optriede kann.Déi meescht DNA Polymerasen, déi fir PCR benotzt ginn, funktionnéieren am Beschten bei Temperaturen ronderëm 68 ° C bis 72 ° C.D'Enzym kann awer och bei méi nidderegen Temperaturen aktiv sinn, awer zu engem méi nidderegen Grad.Bei Temperaturen wäit ënner der Glühungstemperatur kënnen d'Primeren net spezifesch binden an zu enger net spezifescher Amplifikatioun féieren, och wann d'Reaktioun op Äis opgestallt ass.Dëst kann verhënnert ginn andeems Dir Polymerase-Inhibitoren benotzt, déi sech vun der DNA-Polymerase dissoziéieren nëmmen eemol eng gewëssen Temperatur erreecht gëtt, dofir de Begrëff Hot Start PCR.Den Inhibitor kann en Antikörper sinn, deen d'Polymerase bindt an denaturéiert bei der initialer Denaturatiounstemperatur (typesch 95 ° C).

High Fidelity Polymerase

Wärend DNA Polymerasen zimlech präzis op déi ursprénglech Schabloun Sequenz verstäerken, kënne Feeler am Nukleotidmatching optrieden.Mismatches an Uwendungen wéi Klonen kënnen zu trunkéierten Transkriptiounen resultéieren, a falsch iwwersat oder inaktiv Proteine ​​downstream.Fir dës Mëssstänn ze vermeiden, goufen Polymerasen mat enger "Korrektur" Aktivitéit identifizéiert an an de Workflow agebaut.Déi éischt Korrekturpolymerase, Pfu, gouf 1991 am Pyrococcus furiosus identifizéiert.Dëst Pfu Enzym huet eng 3' bis 5' Exonuklease Aktivitéit.Wéi d'DNA amplifizéiert ass, läscht d'Exonuklease net passend Nukleotiden um 3' Enn vum Strang.De richtege Nukleotid gëtt dann ersat, an d'DNA Synthese geet weider.D'Identifikatioun vu falschen Nukleotid Sequenzen baséiert op der verbindlecher Affinitéit fir dat richtegt Nukleosid Triphosphat mam Enzym, wou ineffizient Bindung d'Synthese verlangsamt an de korrekten Ersatz erlaabt.D'Korrekturaktivitéit vu Pfu Polymerase resultéiert a manner Feeler an der leschter Sequenz am Verglach zum Taq DNA Polymerase.An de leschte Joeren sinn aner Korrektur-Enzyme identifizéiert ginn, a Modifikatioune vum ursprénglechen Pfu-Enzym goufen gemaach fir d'Fehlerquote während der DNA-Verstäerkung weider ze reduzéieren.

RT-PCR

Reverse Transcription PCR, oder RT-PCR, erlaabt d'Benotzung vun RNA als Schabloun.En zousätzleche Schrëtt erlaabt d'Detektioun an d'Verstäerkung vu RNA.D'RNA gëtt ëmgedréint an komplementär DNA (cDNA) transkribéiert, mat ëmgedréint Transkriptase.D'Qualitéit an d'Rengheet vun der RNA Schabloun si wesentlech fir den Erfolleg vun RT-PCR.Den éischte Schrëtt vum RT-PCR ass d'Synthese vun engem DNA / RNA Hybrid.Reverse Transkriptase huet och eng RNase H Funktioun, déi den RNA Deel vum Hybrid degradéiert.Déi eenzegstrengeg DNA Molekül gëtt dann duerch d'DNA-ofhängeg DNA Polymerase Aktivitéit vun der ëmgedréint Transkriptase an cDNA ofgeschloss.D'Effizienz vun der Éischt-Strang Reaktioun kann den Amplifikatiounsprozess beaflossen.Vun hei u gëtt d'Standard PCR Prozedur benotzt fir d'cDNA ze verstäerken.D'Méiglechkeet RNA an cDNA duerch RT-PCR zréckzekréien huet vill Virdeeler, an et gëtt haaptsächlech fir Genausdrockanalyse benotzt.RNA ass eenstrengeg a ganz onbestänneg, wat et schwéier mécht mat ze schaffen.Et déngt allgemeng als éischte Schrëtt am qPCR, deen RNA Transkriptiounen an enger biologescher Probe quantifizéiert.

qPCR an RT-qPCR

Quantitative PCR (qPCR) gëtt benotzt fir Nukleinsäuren fir vill Uwendungen z'entdecken, ze charakteriséieren an ze quantifizéieren.Am RT-qPCR ginn RNA Transkripter dacks quantifizéiert andeems se se als éischt an cDNA ëmgedréit ginn, wéi uewen beschriwwen, an dann gëtt qPCR duerno duerchgefouert.Wéi am Standard PCR, gëtt DNA duerch dräi widderhuelend Schrëtt verstäerkt: Denaturatioun, annealing, an elongation.Wéi och ëmmer, am qPCR, fluoreszent Etikettéierung erméiglecht d'Sammlung vun Daten wéi de PCR weidergeet.Dës Technik huet vill Virdeeler wéinst der Gamme vu Methoden a Chemie verfügbar.

A Faarf-baséiert qPCR (typesch gréng), fluoreszent Etikettéierung erlaabt d'Quantifizéierung vun den amplifizéierten DNA Moleküle andeems Dir d'Benotzung vun engem dsDNA bindend Faarf benotzt.Wärend all Zyklus gëtt d'Fluoreszenz gemooss.D'Fluoreszenz Signal erhéicht proportional zu der Quantitéit u replizéierter DNA.Dofir gëtt d'DNA an "Echtzäit" quantifizéiert (Fig. 3).D'Nodeeler fir Dye-baséiert qPCR sinn datt nëmmen een Zil gläichzäiteg iwwerpréift ka ginn an datt d'Faarf un all ds-DNA präsent an der Probe bindet.

An Sonde-baséiert qPCR, kënne vill Ziler gläichzäiteg an all Prouf festgestallt ginn, awer dëst erfuerdert Optimisatioun an Design vun enger Zilspezifesch Sonde (en) déi zousätzlech zu Primer benotzt ginn.Verschidde Aarte vu Sondedesigne si verfügbar, awer déi heefegst Aart ass eng Hydrolysesonde, déi e Fluorophore a Quencher integréiert.Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) verhënnert d'Emissioun vum Fluorophore iwwer de Quencher wärend d'Sond intakt ass.Wéi och ëmmer, wärend der PCR Reaktioun, gëtt d'Sonde hydrolyséiert wärend der Primerverlängerung an der Amplifikatioun vun der spezifescher Sequenz un déi se gebonnen ass.D'Spaltung vun der Sonde trennt de Fluorophore vum Quencher a resultéiert an enger Amplifikatioun-ofhängeger Erhéijung vun der Fluoreszenz (Fig. 4).Also ass de Fluoreszenzsignal vun enger Sonde-baséiert qPCR Reaktioun proportional zum Betrag vun der Sondezielsequenz, déi an der Probe präsent ass.Well Sonde-baséiert qPCR méi spezifesch ass wéi Dye-baséiert qPCR, ass et dacks d'Technologie déi an qPCR-baséiert diagnostesche Assays benotzt gëtt.

Isothermesch Amplifikatioun

D'PCR uewen ernimmt Techniken erfuerdert deier Thermocycling Ausrüstung fir d'Kammertemperaturen fir d'Denaturatioun, d'Annealing an d'Verlängerungsschrëtt präzis erop an erof ze rampelen.Eng Zuel vun Techniken goufen entwéckelt, déi net esou präzis Apparater brauchen a kënnen an engem einfachen Waasserbad oder souguer an den Interessizellen ausgefouert ginn.Dës Technike ginn kollektiv isothermesch Verstäerkung genannt a funktionnéieren op exponentiell, linear oder kaskade Verstäerkung.

Déi bekanntst Aart vun der isothermescher Amplifikatioun ass Loop-mediéiert isothermesch Amplifikatioun, oder LAMP.LAMP benotzt exponentiell Amplifikatioun bei 65⁰C fir Schabloun DNA oder RNA ze verstäerken.Wann Dir LAMP ausféiert, gi véier bis sechs Primer komplementär zu Regioune vun der Zil-DNA mat enger DNA Polymerase benotzt fir nei DNA ze synthetiséieren.Zwee vun dëse Primer hunn komplementär Sequenzen déi Sequenzen an den anere Primer erkennen an se binden, wat et erlaabt eng "Loop" Struktur an der nei synthetiséierter DNA ze bilden déi dann d'Primerannealing an de spéider Amplifikatiounsronn hëlleft.LAMP kann duerch verschidde Methoden visualiséiert ginn, dorënner Fluoreszenz, Agarosegel Elektrophorese oder Kolorimetrie.D'Liichtegkeet fir d'Präsenz oder d'Feele vum Produkt duerch Kolorimetrie ze visualiséieren an z'entdecken an de Mangel un deier Ausrüstung erfuerderlech huet LAMP eng gëeegent Optioun fir SARS-CoV-2 Testen a Beräicher gemaach wou klinesch Labo Tester net einfach verfügbar waren, oder Lagerung an Transport vu Proben war net machbar, oder an Laboe déi virdrun net PCR thermocycling Equipement haten.