Primer Design Basis (99% Probleemer kënne geléist ginn)
1. Primer Längt: D'Léierbuch erfuerdert 15-30bp, normalerweis ongeféier 20bp.Den aktuellen Zoustand ass besser fir 18-24bp ze sinn fir d'Spezifizitéit ze garantéieren, awer wat méi laang dest besser, ze laang Primer wäert och d'Spezifizitéit reduzéieren an d'Ausbezuelung reduzéieren.
2. Primer Amplifikatioun Spann: 200-500bp ass passend, an de Fragment kann op 10kb ënner spezifesche Konditiounen erweidert ginn.
3. Primer Basis: Den Inhalt vu G + C soll 40-60% sinn, ze wéineg G + C Verstäerkungseffekt ass net gutt, zevill G + C ass einfach net spezifesch Bands ze gesinn.ATGC ass am beschten zoufälleg verdeelt, Cluster vu méi wéi 5 Purin oder Pyrimidin Nukleotiden vermeiden.Multi-gc fir de 5 'Enn an Tëschenzäit Sequenzen Stabilitéit ze Erhéijung, vermeiden räich GC um 3' Enn, kee GC fir déi lescht 3 Basen, oder kee GC fir 3 vun de leschten 5 Basen.
4. Vermeiden sekundär Struktur an primers, an evitéieren Ergänzung tëscht zwee primers, virun allem Ergänzung um 3 'Enn, soss primer dimer geformt an Net-spezifesch amplified Bands ginn generéiert.
5. D'Basen am 3 'Enn vun de Primer, besonnesch déi lescht an déi lescht Basen, sollten strikt gepaart ginn fir PCR-Feeler ze vermeiden wéinst onpaarte Terminalbasen.
6. Primer hunn oder kënne mat passenden Spaltplazen hinzugefügt ginn, an déi amplifizéiert Zilsequenz sollt am léifsten entspriechend Spaltplazen hunn, wat ganz gutt ass fir Spaltanalyse oder molekulare Klonen.
7. Spezifizitéit vu Primer: Primer sollten keng offensichtlech Homologie mat anere Sequenzen an der Nukleinsäuresequenzdatebank hunn.
8. Léiert Software ze benotzen: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Dëst Online Design funktionnéiert am Beschten).
Den uewe genannten Inhalt kann op d'mannst 99% vun de Primer Designproblemer léisen.
Kontrolléiert d'Detailer vum Primer Design
1. Primer Längt
Allgemeng Primerlängt ass 18 ~ 30 Basen.Am Allgemengen ass de wichtegste Faktor fir d'Annealtemperatur vum Primer ze bestëmmen d'Längt vum Primer.D'Annealtemperatur vum Primer gëtt allgemeng gewielt (Tm Wäert -5 ℃), an e puer benotzen direkt den Tm Wäert.Déi folgend Formelen kënne benotzt ginn fir d'Annealtemperatur vu Primer ongeféier ze berechnen.
Wann d'Längt vum Primer manner wéi 20bp ass: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Wann d'Längt vum Primer méi wéi 20bp ass: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (% GC) -500 / Längt - 5 ℃
Zousätzlech kënne vill Software och benotzt ginn fir d'Glühungstemperatur ze berechnen, de Berechnungsprinzip wäert anescht sinn, sou datt heiansdo de berechente Wäert e klenge Spalt hunn.Fir PCR Reaktiounen ze optimiséieren, ginn déi kürzest Primer, déi d'Annealtemperaturen vun net manner wéi 54 ℃ garantéieren, fir déi bescht Effizienz a Spezifizitéit benotzt.
Insgesamt erhéicht d'Primer Spezifizitéit mat engem Faktor vu véier fir all zousätzlech Nukleotid, sou datt d'Mindestprimerlängt fir déi meescht Uwendungen 18 Nukleotiden ass.Déi iewescht Limite vun der Primerlängt ass net ganz wichteg, haaptsächlech am Zesummenhang mat der Reaktiounseffizienz.Wéinst der Entropie, wat méi laang de Primer ass, dest méi niddereg ass den Taux mat deem et anneals fir un d'Zil-DNA ze binden fir eng stabil duebelstrengeg Schabloun ze bilden fir DNA Polymerase ze binden.
Wann Dir Software benotzt fir Primer ze designen, kann d'Längt vun de Primer am Tour duerch TM Wäert bestëmmt ginn, besonnesch fir Primer vu Fluoreszenz quantitative PCR, TM = 60 ℃ oder sou soll kontrolléiert ginn.
2.GC Inhalt
Allgemeng ass den Inhalt vu G + C an Primer Sequenzen 40% ~ 60%, an GC Inhalt an Tm Wäert vun engem Paar Primer solle koordinéiert ginn.Wann der primer huet eng sérieux GC oder AT Tendenz, passenden Betrag vun A, T oder G an C Schwäif kann op de 5 'Enn vun der primer dobäi ginn.
3. Annealing Temperatur
D'annealing Temperatur soll 5 ℃ manner wéi d'Unchain Temperatur sinn.Wann d'Zuel vun de Primerbasen kleng ass, kann d'Annealtemperatur entspriechend erhéicht ginn, wat d'Spezifizitéit vum PCR erhéijen kann.Wann d'Zuel vun de Basen grouss ass, kann d'Glühungstemperatur entspriechend reduzéiert ginn.D'annealing Temperatur Ënnerscheed tëscht engem Pair vun primers vun 4 ℃ ~ 6 ℃ wäert net d'PCR Rendement Afloss, mee am Idealfall ass d'annealing Temperatur vun engem Pair vun primers déi selwecht, déi tëscht 55 ℃ ~ 75 ℃ variéiere kann.
4. Vermeiden d'sekundär Struktur Beräich vun der amplification Schabloun
Et ass am beschten déi sekundär Strukturregioun vun der Schabloun ze vermeiden wann Dir de verstäerkte Fragment auswielt.Déi stabil sekundär Struktur vum Zilfragment ka virausgesot a geschat ginn duerch relevant Computersoftware, wat hëllefräich ass fir Schablounenauswiel.Experimentell Resultater weisen datt d'Expansioun dacks net erfollegräich ass wann d'fräi Energie (△G) vun der Regioun déi erweidert gëtt manner wéi 58,6 lkJ / mol ass.
5. Mëssverständnis mat Zil-DNA
Wann déi amplifizéiert Zil-DNA Sequenz grouss ass, kann e Primer u verschidden Deeler vun der Zil-DNA binden, wat zu multiple Bands resultéiert am Resultat.Dës Kéier ass et néideg de BLAST Software Testen, Websäit ze benotzen:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Wielt zwou Sequenzen ausrichten (bl2seq).
D'Primer Sequenzen an d'Zone 1 an d'Zil-DNA-Sequenzen an d'Zone 2 ze pechen ass austauschbar, a BLAST berechent komplementär, Antisense an aner Méiglechkeeten, sou datt d'Benotzer net brauchen ze bemierken ob béid Ketten Sënn Ketten sinn.Dir kënnt och d'GI Nummer aginn wann Dir d'GI Nummer vun der Sequenz an der Datebank kennt, also musst Dir net e groussen Deel vun der Sequenz pechen.Endlech, klickt Align op 3 fir ze kucken ob de Primer verschidde homologe Siten an der Zil-DNA huet.
6. Primer Terminal
Den 3 'Enn vum Primer ass wou d'Verlängerung ufänkt, also ass et wichteg fir Mëssverständiser do ze verhënneren.Den 3 'Enn däerf net méi wéi 3 konsekutiv G oder C sinn, well dëst wäert féieren datt de Primer falsch an der G+C Beräicherungssekvensregioun ausgeléist gëtt.Den 3 'Enn kann keng sekundär Struktur bilden, ausser a spezielle PCR (AS-PCR) Reaktiounen, kann den 3' Enn vum Primer net matenee passen.Zum Beispill, wann d'Kodéierungsregioun amplifizéiert ass, sollt den 3 'Enn vum Primer net op der drëtter Positioun vum Codon ofgeschloss ginn, well déi drëtt Positioun vum Codon ufälleg ass fir ze degeneréieren, wat d'Spezifizitéit an d'Effizienz vun der Amplifikatioun beaflosst.Wann Dir Annexiounsprimer benotzt, kuckt op d'Codon-Benotzungstabell, oppassen op biologesch Präferenz, benotzt keng Annexiounsprimer um 3'Enn, a benotzt eng méi héich Konzentratioun vu Primer (1uM-3uM).
7. Sekundär Struktur vu Primer
D'Primer selwer sollten keng komplementär Sequenzen hunn, soss falen d'Primer selwer an Haarnadelstrukturen, an dës sekundär Struktur beaflosst d'Bindung vu Primer a Schabloune wéinst steresche Hindernisser.Wann kënschtlech Uerteel benotzt gëtt, sollten déi kontinuéierlech komplementär Base vu Primer selwer net méi wéi 3bp sinn.Et soll keng Komplementaritéit tëscht den zwee primers ginn, virun allem de komplementar Iwwerlappung vun der 3 'Enn soll d'Bildung vun primer dimer verhënneren ginn.Am Allgemengen sollt et net méi wéi 4 konsekutiv Basen Homologie oder Komplementaritéit tëscht engem Paar Primer sinn.
8. Füügt Markéierer oder Loci
De 5 'Enn huet wéineg Effekt op d'Verstäerkungsspezifizitéit a kann dofir geännert ginn ouni d'Verstäerkungsspezifizitéit ze beaflossen.D'Modifikatioun vun primer 5 'Enn abegraff: Enzym Restriktioun Site dobäi;Label Biotin, Fluoreszenz, Digoxin, Eu3+, etc. Protein bindend DNA Sequenzen aféieren;D'Aféierung vun Mutatiounsplazen, d'Aféierung an d'Mutatiounssequenzen anzeféieren an d'Promotorsequenzen aféieren, etc.. Déi extra Basen wäerte méi oder manner d'Effizienz vun der Amplifikatioun beaflossen an d'Chance vun der Primer-Dimerbildung erhéijen, awer e puer Konzessiounen musse fir den nächste Schrëtt gemaach ginn.Zousätzlech Sequenzen déi net op der Zilsequenz existéieren, wéi Restriktiounsplazen a Promoteur Sequenzen, kënnen un de 5'Enn vum Primer bäigefüügt ginn ouni Spezifizitéit ze beaflossen.Dës Sequenzen sinn net an der Berechnung vun de Primer Tm Wäerter abegraff, awer solle fir Komplementaritéit an intern sekundär Struktur getest ginn.
9. Subclones
Déi meescht vun der Zäit ass PCR nëmme virleefeg Klonen, an da musse mir d'Zielfragment a verschidde Vektoren subklonen, also musse mir zousätzlech Base fir déi nächst Operatioun am PCR Schrëtt designen.
E puer Sequenzen entworf fir Subklonen ginn hei ënnen zesummegefaasst.
Restriktioun Endonuclease Restriktioun Site gouf dobäi
Enzym Restriktiounsplazen addéieren ass déi meescht benotzt Method fir PCR Produkter ze subklonen.Allgemeng ass de Spaltplaz sechs Basen, zousätzlech zum 5 'Enn vun der Spaltplaz musse 2 ~ 3 Schutzbasen derbäi ginn.Wéi och ëmmer, d'Zuel vu Schutzbasen erfuerderlech vu verschiddenen Enzymen ass anescht.Zum Beispill, SalⅠ erfuerdert keng Schutzbasis, EcoRⅤ erfuerdert 1 Schutzbasis, NotⅠ erfuerdert 2 Schutzbasen, an Hind Ⅲ erfuerdert 3 Schutzbasen.
LIC füügt de Schwanz
De ganzen Numm vum LIC ass Ligation-Onofhängeg Klonen, eng Klonemethod erfonnt vum Navogen speziell fir säin Deel vum pET Vektor.De pET Carrier virbereet duerch d'LIC Method huet net-komplementär 12-15 Base Single String Sticky Ends, déi déi entspriechend klebrig Enden am Zil-Insert Fragment ergänzen.Fir Verstäerkungszwecker soll de Primer 5′ Sequenz vum agebaute Fragment den LIC Vektor ergänzen.D'3′→5′ extranect Aktivitéit vun der T4 DNA Polymerase kann no enger kuerzer Zäit en eenzege Strang plakeg Enn op dem agebaute Fragment bilden.Well d'Produkt nëmmen aus der géigesäiteger Glühung vum preparéierten Insertfragment an dem Vektor geformt ka ginn, ass dës Method ganz séier an effizient, an et ass riicht Klonen.
Direkter TA Klon addéieren Schwanz
TA Klonen konnt net d'Fragment an e Vektor zielen, sou datt spéider Invitrogen e Vektor agefouert huet, dee Klonen zielt, deen véier prominent Basis GTGGS op engem Enn enthält.Dofir, am Design vu PCR-Primeren, sollten komplementär Sequenzen entspriechend derbäi ginn, sou datt Fragmenter "orientéiert" kënne ginn.
Wann Dir kuerz Zäit hutt, kënnt Dir direkt Synthese probéieren, de Gen mat dem Vektor ze kombinéieren, wat mir ET Gen Synthese bei Musecularisten nennen.
D. In-Fusion Klonen Method
Keng Ligase erfuerderlech, keng laang Reaktioun erfuerderlech.Soulaang eng Sequenz op béide Enden vum lineariséierte Vektor agefouert gëtt Am Design vu Primer, da ginn de PCR-Produkt an de lineariséierte Vektor an d'In-Fusiouns-Enzymléisung mat BSA bäigefüügt an eng hallef Stonn bei Raumtemperatur plazéiert, kann d'Transformatioun duerchgefouert ginn.Dës Method ass besonnesch gëeegent fir grouss Volume Konversioun.
10. Fusioun primer
Heiansdo ass nëmme limitéiert Sequenzinformatioun iwwer Primer Design bekannt.Zum Beispill, wann nëmmen d'Aminosaier Sequenz bekannt ass, kann de Fusiounsprimer entworf ginn.E Fusiounsprimer ass eng Mëschung vu verschiddene Sequenzen déi all déi verschidde Basisméiglechkeeten representéieren déi eng eenzeg Aminosaier codéieren.Fir d'Spezifizitéit z'erhéijen, kënnt Dir op d'Codon Benotzungstabell referenzéieren fir d'Annexioun no Basisnotzungsvirléiften vun verschiddenen Organismen ze reduzéieren.Hypoxanthin kann mat all de Basen gepaart ginn fir d'Annealtemperatur vum Primer ze reduzéieren.Benotzt net déi annexéiert Basen um 3'Enn vum Primer, well d'Annealung vun de leschten 3 Basen um 3'Enn genuch ass fir PCR op der falscher Plaz ze initiéieren.Méi héich Primer Konzentratioune (1μM bis 3μM) gi benotzt well Primer a ville Annexiounsmëschungen net spezifesch fir d'Zilschabloun sinn.
PCR Matière premièrekontrolléieren
1. Primer Quantitéit
D'Konzentratioun vun all Primer ass 0,1 ~ 1umol oder 10 ~ 100pmol.Et ass besser dat erfuerdert Resultat mat der niddregsten Quantitéit Primer ze produzéieren.Héich Konzentratioun vu Primer wäert Mëssmatch an net spezifesch Amplifikatioun verursaachen, an d'Chance erhéijen fir Dimeren tëscht Primer ze bilden.
2. Primer Konzentratioun
D'Konzentratioun vu Primer beaflosst d'Spezifizitéit.Déi optimal Primer Konzentratioun ass normalerweis tëscht 0,1 an 0,5μM.Méi héich Primer Konzentratioune féieren zu Amplifikatioun vun net spezifesche Produkter.
3. Annealing Temperatur vun Primer
En anere wichtege Parameter fir Primer ass d'Schmelztemperatur (Tm).Dëst ass d'Temperatur wann 50% vun de Primer a komplementäre Sequenzen als duebelstrengeg DNA Moleküle vertruede sinn.Tm ass erfuerderlech fir PCR Glühtemperatur ze setzen.Ideal ass d'Annealtemperatur niddereg genuch fir effektiv Glühung vun de Primer mat der Zilsequenz ze garantéieren, awer héich genuch fir net spezifesch Bindung ze reduzéieren.Raisonnabel annealing Temperatur vun 55 ℃ bis 70 ℃.D'Annealtemperatur ass normalerweis 5 ℃ manner wéi Tm vum Primer festgeluegt.
Et gi verschidde Formelen fir Tm ze setzen, déi vill variéieren ofhängeg vun der benotzter Formel an der Sequenz vun de Primer.Well déi meescht Formelen e geschätzte Tm Wäert ubidden, sinn all Glühtemperaturen nëmmen e Startpunkt.Spezifizitéit kann verbessert ginn andeems verschidde Reaktiounen analyséiert ginn, déi d'Annealtemperatur progressiv erhéijen.Fänkt ënner dem geschätzte Tm-5 ℃ un, a graduell erhéicht d'Glühungstemperatur an engem Inkrement vun 2 ℃.Méi héije Glühungstemperatur reduzéiert d'Bildung vu Primerdimeren an net spezifesche Produkter.Fir bescht Resultater sollten déi zwee Primer ongeféier Tm Wäerter hunn.Wann den Tm Differenz vun de Primer Pairen méi wéi 5 ℃ ass, weisen d'Primeren e wesentleche falschen Start mat enger méi niddereger Glühungstemperatur am Zyklus.Wann déi zwee Primer Tm anescht sinn, setze d'Annealtemperatur op 5 ℃ manner wéi déi niddregst Tm.Alternativ, fir d'Spezifizitéit ze erhéijen, kënnen fënnef Zyklen als éischt bei Glühtemperaturen entworf ginn fir méi héije Tm, gefollegt vun de verbleiwen Zyklen bei Glühtemperaturen entworf fir méi niddereg Tm.Dëst erlaabt eng deelweis Kopie vun der Destinatioun Schabloun ënner enk Konditiounen ze kréien.
4. Primer Rengheet a Stabilitéit
D'Standard Rengheet vu personaliséierte Primer ass adäquat fir déi meescht PCR Uwendungen.D'Entfernung vu Benzoyl- an Isobutylylgruppen duerch Ofsaltung ass minimal an stéiert dofir net mat PCR.E puer Uwendungen erfuerderen d'Rengung fir all net-Volllängt Sequenzen am Syntheseprozess ze läschen.Dës ofgeschnidden Sequenzen geschéien well d'Effizienz vun der DNA Synthesechemie net 100% ass.Dëst ass e kreesfërmege Prozess dee widderholl chemesch Reaktiounen benotzt wéi all Basis bäigefüügt gëtt fir DNA vun 3 'bis 5' ze maachen.Dir kënnt an all Zyklus versoen.Méi laang Primer, besonnesch déi méi wéi 50 Basen, hunn e groussen Undeel vun ofgeschniddene Sequenzen a kënnen d'Rengung erfuerderen.
D'Ausbezuele vu Primer gëtt beaflosst vun der Effizienz vun der synthetescher Chimie an der Reinigungsmethod.Biopharmazeutesch Firmen, wéi Cytologie a Shengong, benotzen all e Minimum OD Eenheet fir de Gesamtoutput vun Oligonukleosid ze garantéieren.Benotzerdefinéiert Primer ginn an dréchen Pulverform geschéckt.Et ass am beschten d'Primeren am TE nei opzeléisen sou datt d'final Konzentratioun 100μM ass.TE ass besser wéi deioniséiert Waasser well de pH vum Waasser dacks sauer ass a wäert d'Hydrolyse vun Oligonukleosiden verursaachen.
D'Stabilitéit vun de Primer hänkt vun de Lagerbedéngungen of.Dréchent Pudder an opgeléist Primer solle bei -20 ℃ gespäichert ginn.Primer opgeléist an TE bei Konzentratioune méi wéi 10μM kënne stabil bei -20 ℃ fir 6 Méint gelagert ginn, awer kënnen nëmme bei Raumtemperatur (15 ℃ bis 30 ℃) fir manner wéi 1 Woch gelagert ginn.Dréche Pulverprimer kënne bei -20 C fir mindestens 1 Joer a bei Raumtemperatur (15 C bis 30 C) bis zu 2 Méint gelagert ginn.
5. Enzymen an hir Konzentratioune
De Moment ass d'Taq DNA Polymerase déi benotzt gëtt am Fong de Gentechnik Enzym synthetiséiert vu coliforme Bakterien.D'Quantitéit un Enzym néideg fir eng typesch PCR Reaktioun ze katalyséieren ass ongeféier 2.5U (bezunn op de Gesamtreaktiounsvolumen vun 100ul).Wann d'Konzentratioun ze héich ass, kann et zu net spezifescher Amplifikatioun féieren;Wann d'Konzentratioun ze niddreg ass, gëtt d'Quantitéit u syntheteschen Produkt reduzéiert.
6. Qualitéit an Konzentratioun vun dNTP
D'Qualitéit vum dNTP ass enk mat der Konzentratioun an der Effizienz vun der PCR Amplifikatioun verbonnen.Den dNTP-Pulver ass granulär, a seng Variabilitéit verléiert seng biologesch Aktivitéit wann et falsch gelagert gëtt.dNTP Léisung ass sauer, a soll an héijer Konzentratioun benotzt ginn, mat 1M NaOH oder 1M Tris.HCL Pufferléisung fir säi PH op 7.0 ~ 7.5, kleng Quantitéit vun Ënnerverpackungen, gefruerene Lagerung bei -20 ℃ unzepassen.Multiple Afréiere-Daching wäert dNTP degradéieren.An der PCR Reaktioun soll dNTP 50 ~ 200umol/L sinn.Besonnesch Opmierksamkeet sollt op d'Konzentratioun vun de véier DNTPS bezuelt ginn soll gläich sinn (gläiche Mol Virbereedung).Wann d'Konzentratioun vun engem vun hinnen anescht ass wéi déi aner (méi héich oder méi niddereg), gëtt Mëssmatch verursaacht.Ze niddreg Konzentratioun wäert d'Ausbezuele vu PCR Produkter reduzéieren.dNTP kann mat Mg2+ kombinéieren an d'Konzentratioun vu gratis Mg2+ reduzéieren.
7. Schabloun (Ziel Gen) Nukleinsäure
De Betrag an d'Reinigungsgrad vun der Schabloun Nukleinsäure ass ee vun de Schlëssellinks fir den Erfolleg oder den Echec vu PCR.Déi traditionell DNA Reinigungsmethoden benotzen normalerweis SDS a Protease K fir Exemplare ze verdauen an ze entsuergen.D'Haaptfunktioune vum SDS sinn: Lipiden a Proteinen op der Zellmembran opléisen, sou datt d'Zellmembran zerstéiert gëtt andeems d'Membranproteine opléisen, an d'Nuklearproteine an der Zell dissoziéieren, SDS kann och mat Proteinen kombinéieren an ausfällen;Protease K kann Proteine hydrolyséieren an verdauen, besonnesch Histonen, déi mat DNA gebonnen sinn, an dann organesch Léisungsmëttel Phenol a Chloroform benotzen fir Proteinen an aner Zellkomponenten ze extrahieren, a benotzt Ethanol oder Isopropyl Alkohol fir Nukleinsäure auszeschléissen.Déi extrahéiert Nukleinsäure kann als Schabloun fir PCR Reaktiounen benotzt ginn.Fir allgemeng klinesch Detektiounsprouwen kann eng séier an einfach Method benotzt ginn fir Zellen opzeléisen, Pathogenen ze lyséieren, Proteinen aus Chromosomen op fräi Zilgenen ze verdauen an ze entfernen, an direkt fir PCR Amplifikatioun benotzt.RNA Template Extraktioun benotzt normalerweis Guanidin Isothiocyanat oder Protease K Method fir ze verhënneren datt RNase RNA degradéiert.
8.Mg2+ Konzentratioun
Mg2+ huet e wesentlechen Effekt op d'Spezifizitéit an d'Ausbezuelung vun der PCR Amplifikatioun.Allgemeng PCR Reaktioun, wann d'Konzentratioun vu verschiddenen dNTP 200umol/L ass, ass déi entspriechend Konzentratioun vu Mg2+ 1,5 ~ 2,0mmol/L.Mg2+ Konzentratioun ass ze héich, d'Reaktiounsspezifizitéit fällt erof, net spezifesch Amplifikatioun geschitt, ze niddreg Konzentratioun wäert d'Aktivitéit vun Taq DNA Polymerase reduzéieren, wat zu der Reduktioun vun de Reaktiounsprodukter resultéiert.
Magnesiumionen beaflossen verschidden Aspekter vum PCR, wéi DNA Polymerase Aktivitéit, wat d'Ausbezuelung beaflosst;En anert Beispill ass Primer annealing, wat d'Spezifizitéit beaflosst.dNTP a Schabloun binden un Magnesiumion, reduzéiert d'Quantitéit u fräi Magnesiumion, déi fir Enzymaktivitéit erfuerderlech ass.Déi optimal Magnesiumionkonzentratioun variéiert fir verschidde Primerpaaren a Templates, awer eng typesch PCR Startkonzentratioun mat 200μM dNTP ass 1.5mM (Notiz: Fir Echtzäit quantitativ PCR, benotzt 3 bis 5mM Magnesiumionléisung mat enger fluoreszenter Sonde).Méi héich Konzentratioune vu fräie Magnesiumionen erhéijen d'Ausbezuelung, awer erhéijen och net spezifesch Verstäerkung a verréngert Vertrauen.Fir déi optimal Konzentratioun ze bestëmmen, goufen Magnesiumion Titratiounen an Inkremente vun 0.5mM vun 1mM bis 3mM gemaach.Fir d'Ofhängegkeet vun der Magnesiumionoptimiséierung ze reduzéieren, kann Platin Taq DNA Polymerase benotzt ginn.Platin Taq DNA Polymerase ass fäeg d'Funktioun iwwer eng méi breet Palette vu Magnesiumionkonzentratioune wéi Taq DNA Polymerase z'erhalen an erfuerdert dofir manner Optimiséierung.
9. Pcr-förderen Zousätz
Optimisatioun vun annealing Temperatur, Primer Design, a Magnesium Ion Konzentratioun ass genuch fir héich spezifesch amplification vun meeschte Skeletter;awer, puer Schablounen, dorënner déi mat héich GC Inhalt, verlaangen zousätzlech Mesuren.Additive, déi d'Schmelztemperatur vun der DNA beaflossen, bidden en anere Wee fir d'Produktspezifizitéit an d'Ausbezuelung ze verbesseren.Voll Denaturatioun vun der Schabloun ass erfuerderlech fir bescht Resultater.
Zousätzlech verhënnert déi sekundär Struktur d'Primerbindung an d'Enzymverlängerung.
PCR-Additive, dorënner Formamid, DMSO, Glycerin, Betain, a PCRx Enhancer Solution, verbesseren d'Verstäerkung.Hire méigleche Mechanismus ass d'Schmelztemperatur ze reduzéieren, sou datt d'Annealung vu Primer hëlleft an d'DNA Polymerase Verlängerung duerch déi sekundär Strukturregioun hëlleft.PCRx Léisung huet aner Virdeeler.Minimal Magnesiumionoptimiséierung ass erfuerderlech wann se mat Platin Taq DNA Polymerase a Platin Pfx DNA Polymerase benotzt ginn.Also ass d'Platin Technik kombinéiert mat der Additiv fir d'Spezifizitéit ze erhéijen an d'Ofhängegkeet vun der drëtter Approche ze reduzéieren, Magnesiumionoptimiséierung.Fir bescht Resultater sollt d'Konzentratioun vun Additive optimiséiert ginn, besonnesch DMSO, Formamid a Glycerin, déi Taq DNA Polymerase hemmen.
10. Hot ufänken
Hot Start PCR ass eng vun de wichtegste Methoden fir d'PCR Spezifizitéit zousätzlech zu gudde Primer Design ze verbesseren.Och wann déi optimal Verlängerungstemperatur vun Taq DNA Polymerase 72 ℃ ass, bleift d'Polymerase aktiv bei Raumtemperatur.Also ginn net spezifesch Produkter produzéiert wann d'Halttemperatur méi niddereg ass wéi d'Annealtemperatur wärend der Virbereedung vun der PCR Reaktioun an am Ufank vum thermesche Zyklus.Eemol geformt, ginn dës net spezifesch Produkter effektiv verstäerkt.Hot-Start PCR ass besonnesch effektiv wann d'Siten, déi fir Primer Design benotzt ginn, limitéiert sinn duerch d'Plaz vun geneteschen Elementer, sou wéi Site-directed Mutatiounen, Ausdrock Klonen, oder Konstruktioun a Manipulatioun vun geneteschen Elementer, déi fir DNA Ingenieur benotzt ginn.
Eng gemeinsam Method fir d'Aktivitéit vun Taq DNA Polymerase ze limitéieren ass PCR Reaktiounsléisung op Äis ze preparéieren an an engem virgehëtzten PCR Apparat ze setzen.Dës Method ass einfach a preiswert, awer et fäerdeg d'Aktivitéit vum Enzym net an dofir eliminéiert d'Verstäerkung vun net spezifesche Produkter net komplett.
Thermesch Primen verspéit d'DNA Synthese andeems en e wesentleche Bestanddeel hemmt bis de PCR Apparat d'Denaturatiounstemperatur erreecht.Déi meescht manuell thermesch Initiatiounsmethoden, dorënner verspéiten Zousatz vun Taq DNA Polymerase, sinn ëmständlech, besonnesch fir High-Throughput Uwendungen.Aner thermesch priming Methoden benotzen e Wachsschëld fir e wesentleche Bestanddeel, dorënner Magnesiumionen oder Enzymen, ofzeschléissen, oder fir kierperlech reaktiv Komponenten ze isoléieren, wéi Templates a Puffer.Wärend dem thermesche Zyklus ginn déi verschidde Komponente fräigelooss a gemëscht wéi d'Wachs schmëlzt.Wéi déi manuell Hot Start Method, ass d'Wax Shield Method ëmständlech an ufälleg fir Kontaminatioun an ass net gëeegent fir Applikatiounen mat héijen Duerchsatz.
Platin DNA Polymerase ass bequem an effizient fir automatesch Hot Start PCR.Platin Taq DNA Polymerase besteet aus rekombinanter Taq DNA Polymerase kombinéiert mat monoklonalen Antikörper géint Taq DNA Polymerase.D'Antikörper ginn duerch PCR formuléiert fir d'Enzymaktivitéit während enger längerer Temperaturhaltung ze hemmen.Taq DNA Polymerase gouf an d'Reaktioun während der 94 ℃ Isolatioun vum Denaturatiounsschrëtt verëffentlecht, déi voll Polymerase Aktivitéit restauréiert.Am Géigesaz zu chemesch modifizéierten Taq DNA Polymerase fir thermesch Initiatioun, erfuerdert Platin Enzym keng verlängert Isolatioun bei 94 ℃ (10 bis 15 Minutten) fir d'Polymerase ze aktivéieren.Mat PlatinumTaq DNA Polymerase, 90% vun Taq DNA Polymerase Aktivitéit gouf no 2 Minutte bei 94 ℃ restauréiert.
11. Nest-PCR
Successiv Ronne vun der Verstäerkung mat nërdleche Primer kënnen d'Spezifizitéit an d'Sensibilitéit verbesseren.Déi éischt Ronn ass eng Standardverstäerkung vu 15 bis 20 Zyklen.Eng kleng Fraktioun vum initialen Amplifikatiounsprodukt gouf 100 bis 1000 Mol verdünnt an an déi zweet Ronn vun der Amplifikatioun fir 15 bis 20 Zyklen bäigefüügt.Alternativ kann den initialen amplifizéierte Produkt duerch Gelreinigung Gréisst ginn.En nestet Primer gëtt an der zweeter Ronn vun der Amplifikatioun benotzt, déi un d'Zielsequenz am éischte Primer ka bindelen.D'Benotzung vun nestéierten PCR reduzéiert d'Méiglechkeet vun der Amplifikatioun vu multiple Zilplazen well et wéineg Zilsequenzen ergänzen zu béide Sets vu Primer.Déi selwecht Gesamtzuel vun Zyklen (30 bis 40) mat de selwechte Primer verstäerkt déi net spezifesch Siten.Nested PCR erhéicht d'Sensibilitéit vu limitéierten Zilsequenzen (zB rare mrnas) a verbessert d'Spezifizitéit vu schwieregen PCRS (zB 5' RACE).
12. erofgaang PCR
Descending PCR verbessert Spezifizitéit andeems enk annealing Bedéngungen fir déi éischt Zyklen vum PCR benotzt.Den Zyklus fänkt bei enger Glühtemperatur ongeféier 5 ℃ méi héich wéi déi geschätzte Tm un, dann gëtt all Zyklus ëm 1 ℃ bis 2 ℃ reduzéiert bis d'Glühungstemperatur ënner Tm 5 ℃ ass.Nëmmen d'Destinatiounsschabloun mat der héchster Homologie gëtt verstäerkt.Dës Produkter ginn weider an de spéideren Zyklen ausbauen, déi verstäerkt netspezifesch Produkter ausdrécken.Descending PCR ass nëtzlech fir Methoden wou de Grad vun der Homologie tëscht Primer an Zilschabloun net bekannt ass, sou wéi AFLP DNA Fangerofdrock.
Zesummenhang PCR Kits
Den 2× PCR HeroTMMix System huet méi héich Toleranz fir PCR Inhibitoren wéi den normale PCR Mix System, a kann einfach mat PCR Verstäerkung vu verschiddene komplexe Templates eens.Den eenzegaartege Reaktiounssystem an den héicheffizienten Taq Hero maachen d'PCR Reaktioun méi héich Amplifikatiounseffizienz, Spezifizitéit a Sensibilitéit.
Méi héich Verstäerkungseffizienz
Et huet 5'→3' DNA Polymerase Aktivitéit an 5'→3' Exonuclease Aktivitéit, ouni 3'→5' Exonuclease Aktivitéit.
Echtzäit PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Spezifesch-optimiséiert Puffer an Hot-Start Taq Enzym kann net spezifesch Amplifikatioun a Primer Dimer Bildung verhënneren
Héich Empfindlechkeet - kann niddereg Kopien vun der Schabloun entdecken
De Kit benotzt en eenzegaartege Foregene Reverse Transkriptiounsreagens a Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinéiert mat engem eenzegaartege Reaktiounssystem fir effektiv d'Verstäerkungseffizienz a Spezifizitéit vun der Reaktioun ze verbesseren.
Post Zäit: Mee-09-2023
