RT-qPCR Experiment ëmfaasst RNS Extraktioun a Qualitéit Bewäertung, ëmgedréint Transkriptiouns an qPCR dräi Schrëtt, all Schrëtt huet vill Virsiichtsmoossnamen, wäerte mir am Detail ënnendrënner aféieren.

Ⅰ.RNA Qualitéit Bewäertung

Am RT-qPCR Experiment, nom Ofschloss vun der RNA Extraktioun, muss d'Qualitéit vun der RNA evaluéiert ginn, an de Suivi Experiment kann nëmme gemaach ginn nodeems et qualifizéiert ass.Evaluatiounsmethoden enthalen Spektrofotometer, Agilent Gel Elektrophorese, Agilent 2100 Analyse, dorënner de meescht benotzte Spektrofotometer an Agarose Gel Elektrophorese Method Detektioun.Et sollt bemierkt datt dës zwou Methoden zesumme musse benotzt ginn fir d'Detektioun an d'Analyse vun der RNA Konzentratioun, der Rengheet an der Integritéit ze kompletéieren, fir d'Qualitéit vum RNA ze garantéieren.

Zesummenhang RNA Isolatioun Kit: 

Zell Total RNA Isolatioun Kit

Héich gereinegt a qualitativ héichwäerteg total RNA kann aus verschiddene kultivéierten Zellen an 11min kritt ginn.

Déier Total RNA Isolatioun Kit

Schnell an effizient extrahéiert héich Rengheet an héichqualitativ total RNA aus verschiddenen Déieregewebe.

Spektrofotometer:

De Spektrofotometer gëtt haaptsächlech benotzt fir d'Konzentratioun an d'Rengheet vun der RNA ze bestëmmen, awer et kann d'Integritéit vum RNA a de genomesche Rescht net erkennen.Ënnert hinnen, A260/280 an A260/230 si wichteg Parameter fir RNA Rengheet Detektioun, an RNA Rengheet kann no der Schwankung vun hire Wäerter festgestallt ginn:

1.1.9 2.1, beweist méiglech partiell Degradatioun vun RNA, déi duerch Agarose Gel electrophoresis weider bestätegt ginn.

2. 2.0 < A260/230 < 2.2, wat beweist datt d'RNA Rengheet gutt ass;A260/230 < 2.0, wat beweist datt et Reschter vun organeschen Reagens an RNA kënne sinn, wéi Phenolen, Ethanol oder Zucker.

Agarose Gel Elektrophorese:

Agarose Gel Elektrophorese Assay kann d'RNA Integritéit, de Genom a Proteinreschter analyséieren, awer kann d'Konzentratioun vu RNA net präzis quantifizéieren oder d'Reschter vun organeschen Reagenzen entdecken.Huelt eukaryotesche RNA Templates zum Beispill:

1. D'RNA gouf op Agarosegel Elektrophorese ënnerworf.Wann et nëmmen dräi eenzel Bands vun 28sRNA, 18sRNA an 5.8sRNA op der Gel Kaart waren, weist et datt d'extraktéiert RNA intakt ass.Wann et e Phänomen dréint, beweist et deelweis Degradatioun vun der RNA.

2. Wann et eng eenzeg hell Band tëscht dem Klebstoff an der 28sRNA Band ass, kann et genomesch DNA Reschter sinn.

3. Wann Bands am Kleeblatt erscheinen, beweist et datt et Reschter vu Protein an aner makromolekulare Substanzen sinn.

Ⅱ. Reverse Transkriptioun

Nodeems d'RNA Extraktioun ofgeschloss ass, muss et an cDNA ëmgedréit ginn fir spéider Experimenter, sou datt de Reversal Schrëtt wesentlech ass.Ëmgekéiert Transkriptioun gëtt aus der Auswiel vu Reverse Transkriptase a Primer agefouert:

Reverse Transkriptase Selektioun:

Déi typesch ëmgedréint Transkriptasen enthalen AMV RTase a MMLV RTase.D'RNase H vun AMV RTase huet staark Aktivitéit, kuerz Synthese Längt, niddereg Synthes Betrag a gutt thermesch Stabilitéit (42 ~ 55 ℃).D'RNase H Aktivitéit vu MMLV RTase ass schwaach, d'Syntheselängt ass laang, d'Synthesebetrag ass héich, an d'thermesch Stabilitéit ass schlecht (37 ~ 42 ℃).

Well RNase H Enzym d'Funktioun huet fir d'RNA-Schabloun ze degradéieren, sollt MMLV mat schwaacher RNase H-Aktivitéit präferenz während der ëmgedréint Transkriptioun ausgewielt ginn, an no spéider Gentechnik huet d'thermesch Stabilitéit vum MMLV e qualitative Sprong erreecht.Huelt ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV fir ëmgedréint Transkriptioun) als Beispill ass et eng nei ëmgedréint Transkriptase ausgedréckt an E. coli manipuléierte Bakterien mat der genetescher Rekombinatiounstechnologie.Et ass eng rekombinant DNA-Polymerase déi e komplementäre DNA-Strang aus eenzegstrengeg RNA, DNA oder engem RNA: DNA Hybrid synthetiséiert.Et huet keng RNase H Aktivitéit, staark Stabilitéit, staark RNA Affinitéit, an héich Detektiounsempfindlechkeet.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV fir ëmgedréint Transkriptioun)

Auswiel vu Primer:

Generell falen RT primers an dräi Kategorien: oligo dT, zoufälleg primers, an Gen-spezifesch primers.Wielt gëeegent Primer fir ze benotzen no verschiddenen experimentellen Ufuerderungen.

1. Wann d'Schabloun vun eukaryoteschen Hierkonft ass an de spéiden cDNA fir Routine PCR Amplifikatioun benotzt gëtt, gëtt Oligo (dT) recommandéiert;Wann de spéideren Experiment nëmme fir qPCR benotzt gëtt, gëtt Oligo (dT) recommandéiert fir mat zoufälleg Primer gemëscht ze ginn fir d'Effizienz vun der ëmgedréint Transkriptioun ze verbesseren.

2. Wann d'Schabloun aus Prokaryoten ass, sollten Random Primer oder Genspezifesch Primer fir ëmgedréint Transkriptioun ausgewielt ginn.

Ⅲ.qPCR

Fluoreszenzquantifikatioun gëtt haaptsächlech aus der Auswiel vu quantitativen Methoden, Primer Designprinzipien, ROX Selektioun, Reaktiounssystem Konfiguratioun a Reaktiounsbedéngungen Astellung, etc.

Auswiel vu quantitative Methoden:

Quantitativ Methoden ginn a relativ quantitativ Methoden an absolut quantitativ Methoden opgedeelt.Relativ Quantifikatioun kann benotzt ginn fir den Effekt vu bestëmmte Behandlungsmethoden op Genausdrock z'entdecken, den Ënnerscheed vum Genausdrock zu verschiddenen Zäiten z'entdecken an den Ënnerscheed vum Genausdrock a verschiddene Stoffer ze vergläichen.Absolut Quantifikatioun kann d'Quantitéit vun Nukleinsäure am Virus entdecken an sou weider.Wann Dir Experimenter maacht, musse mir déi entspriechend quantitativ Methoden no eisen eegenen Experimenter wielen.

Primer Design Prinzipien:

Den Design vum Primer fir qPCR ass direkt mat der Amplifikatiounseffizienz a Produktspezifizitéit verbonnen.Dofir ass d'korrekt Design vu gudde Primer den éischte Schrëtt fir erfollegräich qPCR.Am Design vum Primer sollten déi folgend Prinzipien oppassen wann Dir de Prinzip vum konventionelle Primer Design begéint:

1. D'Längt vum Zilfragment gëtt tëscht 100 an 300 bp kontrolléiert;

2. Cross-Exon Design fir den Afloss vu genomesch DNA ze vermeiden;

3. Déi entworf Primer musse fir d'Verstäerkungseffizienz getest ginn, a nëmmen wann d'Verstäerkungseffizienz de Standard erreecht (90-110%) kënne se fir quantitativ Experimenter benotzt ginn;

4. Primer Konzentratioun gëtt normalerweis tëscht 0.1uM an 1.0uM optimiséiert.

Auswiel vunROX:

Am Prozess vun der quantitativer Reaktioun kann ROX den opteschen Weedifferenz, Pipettefehler oder Volumendifferenz duerch Verdampfung a Kondensatioun uniform upassen, wat d'Wiederholbarkeet vun de Resultater verbessert.Wéi och ëmmer, et sollt bemierkt datt d'Auswiel vu ROX mam Instrument verbonnen ass.Wann de qPCR-Instrument d'Funktioun huet fir den Ënnerscheed tëscht Lächer automatesch ze korrigéieren, brauch et net ROX ze addéieren;soss muss et ROX Korrektur derbäi.Kleng Partner beim Kaaf vun Reagenzen mussen no dem Instrument sinn dat benotzt gëtt fir de richtege ROX ze wielen, spéider Feeler vermeiden.

Virbereedung vum Reaktiounssystem:

Reaktiounsvolumen vun 20ul an 50ul si bevorzugt.Déi folgend Saache sollten opmierksam gemaach ginn wann de System formuléiert gëtt:

1. D'Reaktiounssystem muss duerch Belëftung an der ultra-propper Workbench virbereet ginn, nei ddH₂O gëtt fir all Experiment benotzt;

2. All Experiment muss NTC virbereeden fir z'iwwerpréiwen ob et Verschmotzung am System ass, an all Pair vu Primer muss NTC maachen wann Dir de System virbereet;

3. Fir z'entdecken ob et gDNA Reschter an der RNA Schabloun ass, kann NRT fir all Probe fir Detectioun virbereet ginn;

4. Wann Dir de System virbereet, ass et recommandéiert op d'mannst 3 technesch Wiederholungen fir eng Probe ze maachen;

5. Wann d'Schabloun cDNA ass, ass et recommandéiert 5-10 Mol ze verdënnen fir den Inhibitiounseffekt vum Reverse Transkriptiounssystem op qPCR Experiment ze reduzéieren.Et ass besser d'Schabloun Quantitéit duerch Gradient ze entdecken, sou datt de CT Wäert tëscht 20-30 fällt;

6. Bestëmmt déi erfuerderlech Unzuel vun Reaktiounen, erhéicht duerch 5-10% op Basis vun der Unzuel vun Reaktiounen, a berechnen d'Volumenkonfiguratiounsnummer;

7, de System ass virbereet mat der Premix Prinzip, Vermëschung no centrifugation a sécherstellen keng Bubbles;

8, Sou wäit wéi méiglech ënnerstëtzend Verbrauchsmaterial ze wielen.

Zesummenhang RT-qPCR Kit