Et ass bekannt datt am zentrale Dogma RNA den transkriptionelle Vermëttler tëscht DNA a Proteinausdrock ass.Am Verglach mat der Detektioun vun DNA kann d'Detektioun vu RNA méi objektiv den Genausdrock an Organismen reflektéieren.Experimenter mat RNS och: qRT-PCR, RNA-Seq, a Fusioun Gen Detektioun, etc.. Baséierend op d'Charakteristiken vun RNA selwer (den Zocker Ring vun RNA huet eng méi fräi hydroxyl Grupp wéi den Zocker Ring vun DNA), mat enger grousser Zuel vun RNases an der Ëmwelt gekoppelt, RNA ass méi onbestänneg a méi einfach wéi DNA ofgebaut ginn.Müll eran, Müll eraus, wann d'Qualitéit vum RNA net gutt ass, da mussen d'experimentell Resultater onbefriddestellend sinn, speziell manifestéiert als ongenau Daten oder schlecht Widderhuelbarkeet.Dofir sollt méi Opmierksamkeet op d'Veraarbechtung vu RNA bezuelt ginn, an de Link vun der Qualitéitskontroll ass och méi wichteg fir d'Präzisioun an d'Genauegkeet vun de spéideren experimentellen Donnéeën ze garantéieren.

Fir d'Qualitéitskontroll vu RNA ginn et allgemeng déi folgend allgemeng benotzt Methoden:

• Spektrofotometrie
• agarose Gel Elektrophorese
• Agilent Bioanalyzer
• Echtzäit fluoreszent quantitative PCR
• Qubit Fluorescent Dye Method

01 Spektrofotometrie

RNA huet konjugéiert Duebelbindungen an huet en Absorptiounspeak bei enger Wellelängt vun 260nm.Geméiss dem Lambert-Beer säi Gesetz kënne mir d'RNA Konzentratioun aus der Absorptiounspeak bei 260nm berechnen.Zousätzlech kënne mir och d'Rengheet vun der RNA berechnen no dem Verhältnis vun 260nm, 280nm an 230nm Absorptiounspeaks.280nm an 230nm sinn d'Absorptiounspeake vu Proteinen a klenge Molekülen, respektiv.D'Verhältnis vun A260 / A280 an A260 / A230 vun qualifizéiert RNA Rengheet soll méi grouss sinn wéi 2. Wann et manner wéi 2 ass, heescht et, datt et Protein oder kleng Molekül Kontaminatioun an der RNA Prouf ass a muss erëm gereinegt ginn.Kontaminatiounsquellen beaflossen Downstream Experimenter, sou wéi d'Inhibitioun vun der Amplifikatiounseffizienz vun PCR Reaktiounen, wat zu ongenaue quantitative Resultater resultéiert.D'Rengheet vun der RNA huet e groussen Afloss op spéider Resultater, sou datt Spektrofotometrie allgemeng eng onverzichtbar Qualitéitskontrolllink am éischte Schrëtt an Nukleinsäure Experimenter ass.

Figur 1. Typesch RNA / DNA Absorptioun Spektrum

02 Agarosegel Elektrophorese

Zousätzlech zu Rengheet ass d'Integritéit vum RNA och ee vun de wichtege Indikatoren fir d'Qualitéit vun der RNA ze beurteelen.D'Degradatioun vu RNA wäert zu enger grousser Zuel vu kuerze Fragmenter an der Probe féieren, sou datt d'Zuel vun den RNA Fragmenter, déi effektiv erkannt kënne ginn an duerch d'Referenzsequenz ofgedeckt ginn, reduzéiert ginn.RNA Integritéit kann duerch Elektrophorese vum Gesamt-RNA op engem 1% Agarosegel gepréift ginn.Dës Method kann de Gel selwer konfiguréieren, oder benotzt de prefabrizéierten E-Gel™ System fir Integritéitstest.Méi wéi 80% vum GesamtRNA ass ribosomal RNA, d'Majoritéit vun deem besteet aus 28S an 18S rRNA (a Mamendéierensystemer).Gutt Qualitéit RNA wäert zwee offensichtlech hell Baren weisen, déi 28S an 18S hell Baren sinn, respektiv, bei 5 Kb an 2 Kb, an de Verhältnis wäert éischter no bei 2: 1 sinn.Wann et an engem diffusen Zoustand ass, heescht et datt d'RNA Probe degradéiert ka sinn, an et ass recommandéiert d'Method ze benotzen déi spéider beschriwwe gëtt fir d'Qualitéit vum RNA weider ze testen.

Figur 2. Verglach vun degradéiert (Lane 2) an intakt RNA (Lane 3) op agarose gel electrophoresis

03 Agilent Bioanalyzer

Zousätzlech zu der agarose Gel Elektrophorese Method hei uewen beschriwwen, déi eis hëllefe kann d'Integritéit vun der RNA einfach a séier z'identifizéieren, kënne mir och den Agilent Bioanalyzer benotzen fir d'Integritéit vun der RNA ze bestëmmen.Et benotzt eng Kombinatioun vu Mikrofluidik, Kapillär Elektrophorese, a Fluoreszenz fir d'RNA Konzentratioun an d'Integritéit ze bewäerten.Andeems Dir den agebaute Algorithmus benotzt fir de Profil vun der RNA Probe ze analyséieren, kann den Agilent Bioanalyzer e Referenz-RNA-Integritéitswäert, RNA Integrity Number (nach RIN bezeechent) [1] berechnen.Wat méi grouss de Wäert vum RIN ass, wat méi héich ass d'Integritéit vun der RNA (1 ass extrem degradéiert, 10 ass déi komplettst).E puer Experimenter mat RNA involvéiert proposéiere RIN als Parameter fir Qualitéitsbewäertung ze benotzen.Huelt High-Throughput Sequenzéierungsexperimenter (nodréiglech NGS bezeechent) als Beispill, d'Richtlinne vum Oncomine ™ Human Immune Repertoire, dee benotzt gëtt fir B Zell an T Zell Antigen Rezeptoren an der Thermo Fisher's Oncomine Panel Serie z'entdecken, proposéiere datt Proben mat RIN Wäerter méi wéi 4, Méi effektiv gemooss a clotéiert kënne ginn (Finesgure kënne gemooss ginn 3).Et gi verschidde recommandéiert Reihen fir verschidde Paneele, an dacks kann e méi héije RIN méi effektiv Donnéeën bréngen.

Figur 3, an Oncomine ™ Human Immune Repertoire Experimenter, Echantillon mat RIN méi wéi 4 kënne méi effektiv Liesungen an T Zell Klonen entdecken.【2】

Wéi och ëmmer, den RIN Wäert huet och e puer Aschränkungen.Obwuel RIN eng héich Korrelatioun mat der Qualitéit vun NGS experimentell Donnéeën huet, ass et net gëeegent fir FFPE Echantillon.FFPE Echantillon goufen fir eng laang Zäit chemesch behandelt, an der extrahéiert RNA allgemeng e relativ nidderegen RIN Wäert.Dëst bedeit awer net datt d'effektiv Donnéeën vum Experiment net zefriddestellend musse sinn.Fir d'Qualitéit vun FFPE Echantillon präziist ze bewäerten, musse mir aner Miessunge wéi RIN benotzen.Zousätzlech zu RIN, Agilent Bioanalyzer kann och DV200 Wäert als Evaluatiounsparameter vun der RNA Qualitéit berechnen.DV200 ass e Parameter deen den Undeel vu Fragmenter méi grouss wéi 200 bp an enger RNA Probe berechent.DV200 ass e besseren Indikator vun der FFPE Probequalitéit wéi RIN.Fir d'RNA extrahéiert vun FFPE, et huet eng ganz héich Korrelatioun mat der Zuel vun Genen, datt effektiv entdeckt ginn an der Diversitéit vun Genen [3].Och wann DV200 d'Mängel an der Qualitéitserkennung vu FFPE ka kompenséieren, kann den Agilent Bioanalyzer nach ëmmer net d'Qualitéitsprobleemer an RNA Proben analyséieren, och ob et Inhibitoren an de Proben sinn.Inhibitoren selwer kënnen d'Verstäerkungseffizienz vun Downstream Experimenter beaflossen an d'Quantitéit vun nëtzlechen Donnéeën reduzéieren.Fir ze wëssen ob et en Inhibitor an der Probe ass, kënne mir d'Echtzäit fluoreszent quantitativ PCR Method adoptéieren déi nächst beschriwwe gëtt.

04 Echtzäit fluoreszent quantitative PCR

D'Echtzäit fluoreszent quantitativ PCR Method kann net nëmmen d'Inhibitoren an der Probe entdecken, awer och präzis d'Qualitéit vun der RNA an der FFPE Probe reflektéieren.Am Verglach mat Agilent biologesch Analysatoren sinn Echtzäit Fluoreszenz quantitativ Instrumenter méi populär a grousse biologesche Laboratoiren wéinst hirer méi breeder Uwendung.Fir d'Qualitéit vun RNS Echantillon ze Test, brauche mir nëmmen primer Sonden fir intern Referenz Genen ze kafen oder preparéieren, wéi GUSB (Cat Nr. Hs00939627).Andeems Dir dëse Set vu Primer, Sonden a Standards benotzt (total RNA vu bekannter Konzentratioun) fir absolut quantitativ Experimenter ze maachen, kann déi effektiv RNA Fragmentkonzentratioun als Evaluatiounsstandard vun der RNA Qualitéit (Functional RNA Quantitation (FRQ) kuerz) berechent ginn.An engem NGS Test hu mir festgestallt datt d'FRQ vun RNS Echantillon eng ganz héich Korrelatioun mat dem effektiven Datevolumen huet.Fir all Echantillon méi wéi 0.2ng / uL FRQ, op d'mannst 70% vun de Liesunge kënnen effektiv d'Referenzsequenz ofdecken (Figur 4).

Figur 4, der FRQ Wäert vun der fluorescence quantitativ Method festgestallt huet eng ganz héich Korrelatioun (R2> 0,9) mat der efficace Donnéeën am NGS Experiment kritt.Déi rout Linn ass de FRQ Wäert gläich wéi 0,2 ng / uL (log10 = -0,7).【4】

Zousätzlech zu FFPE Proben applicabel ze sinn, kann d'Echtzäit quantitativ PCR Method och effektiv Inhibitoren a Proben iwwerwaachen.Mir kënnen d'Probe addéieren fir an de Reaktiounssystem z'entdecken mat Internal Positive Control (IPC) a senger Assay, an dann d'Fluoreszenzquantifikatioun ausféieren fir de Ct Wäert ze kréien.Wann de Ct-Wäert hannert dem Ct-Wäert an der No-Probe-Reaktioun bleift, weist et un datt den Inhibitor an der Probe präsent ass an d'Verstäerkungseffizienz an der Reaktioun hemmt.

05 Qubit Fluorescent Dye Method

Qubit Fluorometer ass deen am meeschte benotzt klengen Apparat fir Nukleinsäure Konzentratioun a Rengheetserkennung, deen einfach ze bedreiwen ass an existéiert a bal all Molekularebiologie Laboratoire.Et berechent d'Konzentratioun vun Nukleinsäure präzis duerch Detektioun an Nukleinsäurebindende fluoreszent Faarfstoff (Qubit Detektiounsreagens).Qubit huet héich Empfindlechkeet a Spezifizitéit, a kann RNA präziist quantifizéieren bis op pg / µL Konzentratioun.Zousätzlech zu der bekannter Fäegkeet fir d'Nukleinsäurekonzentratioun präzis ze quantifizéieren, kann dem Thermo Fisher säi leschten neie Modell, Qubit 4.0, och d'Integritéit vun der RNA erkennen.Qubit 4.0's RNA Detektiounssystem (RNA IQ Assay) erkennt d'Integritéit vun RNA andeems se gläichzäiteg zwee spezifesch fluoreszent Faarfstoffer erkennen.Dës zwee fluoreszent Faarfstoffer kënnen u grouss Fragmenter a kleng Fragmenter vun RNA binden, respektiv.Dës zwee fluorescent Faarfstoffer weisen den Undeel vu grousse Fragmenter vun RNA an der Probe un, an aus dësem kann den IQ (Integritéit a Qualitéit) Wäert berechent ginn, deen d'RNA Qualitéit representéiert.Den IQ Wäert ass applicabel fir béid FFPE an Net-FFPE Proben, an huet e groussen Afloss op déi spéider Sequenzéierungsqualitéit.NGS Experimenter als Beispill huelen, an den RNA-Seq Testexperimenter, déi op der Ion torrent ™ Plattform gemaach goufen, hunn déi meescht Proben mat IQ Wäerter méi wéi 4 op d'mannst 50% effektiv Liesungen (Figur 5).Am Verglach mat den uewe genannten Detektiounsmethoden ass Qubit IQ Assay net nëmme méi bequem ze bedreiwen an hëlt manner Zäit (bannent fënnef Minutten), awer huet och eng grouss Korrelatioun tëscht dem gemoossene Parameter IQ Wäert an der Datequalitéit vun Downstream Experimenter.

Figure 5, et ass eng grouss Korrelatioun tëscht dem Qubit RNA IQ Wäert an de kartéierte Liesungen vun RNA-Seq.【5】

Duerch déi uewe genannte Aféierung gleewen ech datt jiddereen e genuch Verständnis vu verschiddene RNA Qualitéitskontrollmethoden huet.An der Praxis kënnt Dir wielendéi entspriechend Method no der Prouf Typ an bestehend Instrumenter.Nëmmen duerch d'Qualitéit vun der RNA gutt ze kontrolléieren kënne mir den Echec vu spéider Experimenter vermeiden, déi duerch schlecht Probequalitéit verursaacht ginn, sou datt wäertvoll Zäit, Energie a Käschten spueren.

Referenzprodukter:

Déier Total RNA Isolatioun Kit

Zell Total RNA Isolatioun Kit

Referenze

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S., et al.De RIN: eng RNA Integritéitsnummer fir Integritéitswäerter un RNA Miessunge ze ginn.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 3–720, 3.https://doi.org/10.1093/toxsci/