Mir hunn erlieft Fabrikant beschwéiert.D'Majoritéit an de entscheedende Zertifizéierunge vu sengem Maart gewannen fir Big Discount China High Sensitivity One-Step Sonde Rt-QpcrKit V2, Qualitéit ass d'Liewen vun der Fabréck, Fokus op d'Nofro vum Client ass d'Quell vun der Firma Iwwerliewe an Entwécklung.
Mir hunn erlieft Fabrikant beschwéiert.Gewannen der Majoritéit an der entscheedender Zertifizéierungen vu sengem Maart firChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Eis Firma versprécht: raisonnabel Präisser, kuerz Produktiounszäit an zefriddestellend After-Sales-Service, mir begréissen Iech och fir eis Fabréck zu all Moment ze besichen.Mir wënschen elo eng agreabel a laangfristeg Affär zesummen!!!

Beschreiwunge

Dëse Kit benotzt en eenzegaartege Lysis-Puffersystem, dee séier RNA aus kultivéierten Zellproben fir RT-qPCR Reaktiounen fräigeloosse kann, an doduerch den Zäitopwendende an ustrengenden RNA-Reinigungsprozess eliminéiert.D'RNA Template kann a just 7 Minutten kritt ginn.D'5×Direct RT Mix an 2×Direct qPCR Mix-SYBR Reagens, déi vum Kit geliwwert ginn, kënne séier an effektiv Echtzäit quantitative PCR Resultater kréien.

5×Direct RT Mix an 2×Direct qPCR Mix-SYBR hunn eng staark Inhibitor Toleranz, an d'Lysat vun de Proben kann als Schabloun fir RT-qPCR direkt benotzt ginn.Dëse Kit enthält déi eenzegaarteg RNA héich Affinitéit Foregene ëmgedréint Transkriptase, an Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaktiounsbuffer, PCR Optimisator a Stabilisator.

Spezifikatioune

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Kit Komponente

Fonctiounen & Virdeeler

■ Einfach an effektiv : mat Cell Direct RT Technologie kënnen RNA Proben a just 7 Minutten kritt ginn.

■ D'Probe Nofro ass kleng, sou niddereg wéi 10 Zellen kënnen getest ginn.

■ Héich Débit: et kann séier RNA an Zellen entdecken an 384, 96, 24, 12, 6-Well Platen.

■ DNA Eraser ka séier verëffentlecht Genomen erofhuelen, den Impakt op spéider experimentell Resultater staark reduzéieren.

■ Optimiséiert RT- a qPCR-System mécht déi zwee-Schrëtt RT-PCR ëmgedréint Transkriptioun méi effizient a PCR méi spezifesch, a méi resistent géint RT-qPCR Reaktiounsinhibitoren.

Kit Applikatioun

Ëmfang vun der Applikatioun: kultivéiert Zellen.

- RNA verëffentlecht duerch Probelysis: nëmmen applicabel fir d'RT-qPCR Schabloun vun dësem Kit.

- De Kit kann fir déi folgend Zwecker benotzt ginn: Genausdrock Analyse, Verifizéierung vum siRNA-mediéierten Gen Silencing Effekt, Drogenscreening, etc.

Diagramm

Stockage an Regal Liewen

Deel I vun dësem Kit soll bei 4 ℃ gespäichert ginn;Deel II soll bei -20 ℃ gespäichert ginn.

Foregene Protease Plus II soll bei 4 ℃ gespäichert ginn, net bei -20 ℃ afréieren.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR soll bei -20 ℃ am Däischteren gespäichert ginn;wann et dacks benotzt gëtt, kann et och bei 4 ℃ fir kuerzfristeg Lagerung gespäichert ginn (benotzt innerhalb vun 10 Deeg). Mir sinn erfuerene Fabrikant.D'Majoritéit an de entscheedende Zertifizéierunge vu sengem Maart gewannen fir Grouss Remise China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Qualitéit ass Fabrik' Liewen , Focus op Client' Demande ass d'Quell vun der Firma Iwwerliewe an Entwécklung, Mir halen un Éierlechkeet a guddem Glawen Aarbechtshaltung, freeën eis op Är komm!
Grouss RemiseChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Eis Firma versprécht: raisonnabel Präisser, kuerz Produktiounszäit an zefriddestellend After-Sales-Service, mir begréissen Iech och fir eis Fabrik zu all Moment ze besichen wann Dir wëllt.Mir wënschen elo eng agreabel a laangfristeg Affär zesummen!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Fir Zell direkt RT-qPCR benotzt ≤ 1000.000 Zellen

Produit Aféierung

Dëst Produkt benotzt en eenzegaartege Lysis-Puffer System fir séier RNA aus kultivéierten Zellproben fir RT-qPCR Reaktiounen ze befreien, eliminéiert den Zäitopwendende an ustrengenden RNA Reinigungsprozess, an nëmme 7 Minutten fir déi erfuerderlech RNA Schabloun ze kréien, mat der 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, déi vum Kit geliwwert gëtt, kënne séier an effizient Echtzäit-PCR Resultater kréien.

5× Direct RT Mix an 2× Direct qPCR Mix-Taqman hunn eng staark Inhibitor Toleranz a kënnen effizient Reversal a spezifesch Amplifikatioun ausféieren andeems d'Lysat vun der Probe gemooss gëtt als Schabloun.De Reagens enthält Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaktiounsbuffer, PCR Optimizer a Stabilisator, dee mat Lysisbuffer benotzt ka ginn fir Proben séier a liicht z'entdecken, an huet d'Charakteristike vun héijer Empfindlechkeet, Spezifizitéit a Stabilitéit.

Produit Fonctiounen

Einfach, efficace Cell Direct RT Technologie déi sou wéineg wéi 7 Minutten dauert fir RNA Proben ze kréien.

Prouf Ufuerderunge si kleng, an e Minimum vun 10 kultivéiert Zellen kënne fir Experimenter benotzt ginn.

Héich Débit fir séier RNA Acquisitioun vu kultivéierten Zellen wéi 384, 96, 24, 12 a 6-Well Placke.

DNA Eraser ass fäeg séier verëffentlecht Genomen ze läschen, wat den Impakt op spéider experimentell Resultater staark reduzéiert.

Optimiséiert RT a qPCR Systemer erméiglechen zwee-Schrëtt RT-PCR mat méi effizienter ëmgedréint Transkriptioun, Spezifizitéit a méi staark RT-qPCR Reaktiounsinhibitor Toleranz.

Kit Applikatioun

Ëmfang vun der Applikatioun: Kultivéiert Zellen.

Prouf Lysis interpretéiert RNA: nëmmen als zwee-Schrëtt RT-qPCR Schabloun benotzt.

Kits kënne fir déi folgend Zwecker benotzt ginn: Genregulativ Ausdrock Analyse, Allele Testen, Drogenscreening, etc.

Kit Aschränkungen

Amplifizéiert Fragmenter ≤ 300 bp.

Kits gi benotzt fir frësch Kulturen Zellen.

Produit Qualitéitskontroll

Geméiss dem FOREGENE Total Quality Management System gëtt all Batch vu Cell Direct RT-qPCR Serie Kits rigoréis e puer Mol getest fir d'Zouverlässegkeet an d'Stabilitéit vun der Qualitéit vun all Batch vu Kits ze garantéieren.

Kit Inhalt

*:Zell Lysis, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman kann separat kaaft ginn, Detailer ginn am Appendix 1 (PAGE 13) geliwwert.

Stockage Konditiounen

1. Shipping Konditiounen

De ganze Prozess vum Transport vun enger Eispackkëscht mat niddregen Temperaturen, fir sécherzestellen datt de Kit am <4 °C Zoustand ass.

2. Stockage Konditiounen

Späicheren Deel I bei 4 ° C an Deel II bei -20 ° C.

De Foregene Protease Plus II soll bei 4°C gelagert ginn, net bei -20°C gefruer.

Reagens 2 × Direct qPCR Mix-Taqman gëtt bei -20 ° C gelagert, oder bei 4 ° C fir kuerzfristeg Benotzung wann dacks benotzt (bannent 10 Deeg).

Kit Komponent Informatiounen

Buffer CL: Bitt d'Ëmfeld erfuerderlech fir Zelllysereaktiounen.

Buffer ST: Terminéiert déi aktiv Substanz am Lysat fir Auswierkungen op de spéider RT ze vermeiden.

DNA Eraser: DNA Remover, den Effekt vun der Entfernung vum Genom op spéider Experimenter.

5× Direct RT Mix: Enthält héich RNA Affinitéit Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, Stabilisatoren, Enhancers, Optimizers, and Reverse Transcription Primere fir optimal Ausriichtung (Zoufälleg Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Am Kontext vum Lysis-Puffer ginn Zellen lyséiert fir Nukleinsäuren ze befreien.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Dëse Reagens enthält Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaktiounsbuffer, PCR Optimisator a Stabilisator.

20 × ROX Referenz Dye: Allgemeng benotzt op Echtzäit PCR Verstäerkungsinstrumenter vun ABI, Stratagene an aner Firmen, et gëtt benotzt fir den Ënnerscheed tëscht PCR Réier a Réier unzepassen, verursaacht duerch PCR Doséierungsfehler.D'20 × ROX Referenz Dye Konzentratioun néideg fir verschidden Instrumenter ass anescht, an de Benotzer kann et no der recommandéiert Konzentratioun vum Instrument derbäi.

RNase-Free ddH₂O: RNase-gratis steriliséiert ultra pure Waasser fir zwee-Schrëtt RT-qPCR Reaktiounen.

Virsiichtsmoosnamen:(Gitt sécher d'Virsécherheetsmesuren virsiichteg ze liesen ier Dir de Kit benotzt)

Opgepasst op d'Operatiounsmethod vum Experiment fir Kräizkontaminatioun tëscht Proben ze vermeiden.

Opgepasst op d'Propperheet vum experimentellen Ëmfeld an Geschir fir RNase Kontaminatioun an RNA Degradatioun ze vermeiden.

Huelt frësch oder gutt konservéiert Zellproben a benotzt ni widderholl gefruer-thawed Zellproben.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman soll widderholl Afréiere-Thaw vermeiden, soss wäert et ëmgedréint Transkriptioun an PCR Effizienz beaflossen.

PrepaRatiounevirunOperatioun

Gitt sécher d'Instruktioune virsiichteg ze liesen ier Dir dëse Kit benotzt.De Cell Direct RT-qPCR Kit ass einfach, praktesch a séier ze bedreiwen, an d'Instruktioune liwweren komplett Informatioun iwwer de ganze Kit a wéi Dir et richteg benotzt.Preparéiert w.e.g. déi néideg experimentell Materialien an Ausrüstung virum Gebrauch.

Experimentell Material an Ausrüstung

◆ Kultur Zellen.

◆ 1,5 ml oder 2 ml, RNase-/DNase-Free Zentrifuge Röhre, RNase-/DNase-Free Tipp, 0,2 ml steril qPCR-Rouer.

◆ qPCR Maschinn, Pipette, Tabletop Zentrifuge (≥13.400×g) (ofhängeg vun experimentellen Bedierfnesser), etc.

Sécherheet

◆ Dëst Produkt ass nëmme fir wëssenschaftlech Fuerschungszwecker, benotzt et net fir pharmazeutesch, klinesch, Liewensmëttel a kosmetesch Zwecker.

◆ Wann Dir Chemikalien benotzt, gitt passenden Labo Kleeder, Handschuesch, Schutzbrëll, etc.

OperatiounGuiden

Zell Lysis Systemer, RT Systemer, an qPCR Reaktioun Léisung Zousaz Packs kann separat kaaft ginn, fir Detailer am Appendix 1 (PAGE 13).

Operatioun Guide

A: Probe RNA Verëffentlechung

1.Zelle goufen virbehandelt: Wäscht d'Zellkulturplack mat kale PBS, dann lyséiert d'Zellen (10-10)⁶), 10⁶ wéi d'Zuel vun Zellen, ass recommandéiert Foregene d'Zell an RNA Isolatioun Kit den Total (DE-03111) oder Déier Total RNA Isolatioun Kit (DE-03011) fir RNA Extraktioun an Offäll.

1.1.Adherent Zellen (24-Well Plack als Beispill)

1.1.1.Bestëmmt d'Zuel vun den Zellen an all Brunn, bestëmmt datt d'Zuel vun den Zellen 1 × 10 ass⁵, a benotzt eng Pipette fir d'Kulturmedium aus der Kulturgeschir ze entfernen.

1.1.2.Füügt 200 μl vu virgekillte 1 × PBS an all Well.Pipette net ëmmer erëm a läscht PBS aus de Brunnen.Schréiegt d'Plack an ewechzehuelen sou vill PBS wéi méiglech.Fuert weider op Schrëtt 2.

1.1.3.Verschidden Zell Kultur Plat oder eng Referenz Zuel Dësch 1-1 an engem Zell Kultur Plat war dobäi precooled 1 × PBS fir Zell wäschen.

Table1-1: PBS Doséierung fir verschidden Zuelen vun Zellen

Note:Fir eng fest adherent Zellen ze garantéieren,eng grouss Zuel vu Zellverloscht vermeit beim Wäschen.

1.2.Suspension Zellen oder adherent Zellen an net-poröse Placke kultivéiert

1.2.1.Adherent Zellen cultured an Net-Multi-Well Placke (Suspension Zellen ufänken aus dem nächste Schrëtt 1.2.2), sammelen an trennen d'Zellen no der normal Zell Kollektioun Method, an Plaz hinnen an enger Kultur Plack oder Zentrifuge Rouer;wann Trypsiniséierung benotzt gëtt, erfuerdert Zentrifugatioun fir d'Zellen ze sammelen an d'Rescht Trypsin ze entfernen, bäigefüügt PBS resuspendéiert Zellen an eenzel Zellen fir d'Zellen ze verdeelen.

1.2.2.No der Zuel vun Zellen gezielt, aliquoted Zellen 1 × 10⁵ eent zu centrifuge Réier, sammelen Zellen vun centrifugation bei 1000 × g fir 10 min.

1.2.3.Füügt 200 μl PBS an d'Zentrifugerröhre, pipet net ëmmer erëm, an aspiréiert direkt de PBS.fuert weider op Schrëtt 2. (Wann schwéier ausfällt an d'Zellen erëm suspendéiert goufen, kann 1000 × g 10 min centrifugéiert ginn nodeems de Supernatant ofgeschaaft gouf, d'Zellpellet weider op Schrëtt 2)

2.Cell lysis: Ewechzehuelen Buffer CL, seng Temperatur equilibréiert ze Raumtemperatur, DNA Eraser an Foregene Protease Plus II, no der folgender Tabell 1-2 virbereet lysis System: (Lysis Léisung ass prett fir benotzen).

Dësch 1-2: Spaltung System Virbereedung (Notiz: an der Virbereedung op Äis)

3.(24-Well Plack als Beispill) Pipette 200 μl vun Zell Lysis Meeschtesch Mëschung an all Well, widderholl 5-10 Mol blase, Incubate bei Raumtemperatur (20-25 ℃) fir 5 min.

Note:Fir d'Bildung vu Blasen ze vermeiden, w.e.g. wann d'Pipette Skala op 200μl oder manner ugepasst gouf.D'Zelle kënnen no der Lysis bewölkt ginn, wat normal ass.

4.(24 -well Plack als Beispill) gëtt an der flësseger 20 μl Buffer ST (verschidde Lysissystemer Buffer ST dobäigesat an engem Betrag an der Tabell 1-3 bäigefüügt), repetéiert 5-10 Mol, bei Raumtemperatur (20-25 ℃) fir 2 min inkubéiert.

Note:De Pipettespëtz ass ënner der Uewerfläch entsuergt, a garantéiert datt de Lysat derbäigesat gouf,fir d'Bildung vu Blasen ze vermeiden, w.e.g. wann d'Pipette Skala op 200μl oder manner ugepasst gouf.

Dësch 1-3:Dobäizemaachen Buffer ST

5.D'Lysat gëtt fir spéider RT-qPCR Experimenter benotzt.Wann déi spéider Experimenter net an der Zäit ausgefouert kënne ginn, halen et op Äis fir net méi wéi 2 Stonnen, a späichere bei -20 ℃ oder -80 ℃ (net méi wéi dräi Méint).

B: RT System Virbereedung

1.Take aus 5 × Direct RT Mix an Plaz et op engem Äis Bad, loosse et natierlech schmëlzen, a sanft Mix et fir spéider benotzen;huelt RNase-Free ddH2O eraus a schmëlzt et a setzt se op en Äisbad fir spéider benotzt.Bereet de Reaktiounssystem op Äis no Tabelle 2-1 hei drënner.

Dësch 2-1: Virbereedung vun RT Reaktioun System

2.After Réalisatioun vun System Formuléierung, sanft gemëscht an centrifuged kuerz an der folgender Tabell 2 -2 Reaktioun Konditiounen RT Reaktioun.

Dësch 2-2: RT Reaktioun Conditioun Kader

3.No der Ofschloss vun der Reaktioun gouf d'Reaktiounsprodukt direkt op Äis fir qPCR plazéiert, gitt w.e.g. d'laangfristeg Konservatioun -20 ℃ oder -80 ℃.

Bemierkung: Wéinst der Benotzung vun net gereinegter Schabloun kënnen wäiss Ausfäll am ëmgedréint Transkriptiounsprodukt optrieden.Dëst ass en normalen Phänomen.Zentrifuge den Supernatant direkt fir spéider Experimenter.

Déi resultéierend RT Reaktiounsléisung gëtt an den nächste Step Real Time PCR Reaktiounssystemer bäigefüügt, et ass recommandéiert Quantitéiten ze addéieren, rangéiert vun 10-30% vum Reaktiounssystem.

C: qPCR Reaktioun System Virbereedung

1.Appropriate Betrag vu B virbereet am Schrëtt cDNA Schabloun no der folgender Tabell 3-1 fir e Reaktiounssystem ze preparéieren.

Notiz: De Betrag vun der cDNA Schabloun stellt 10-30% vum qPCR System aus.Zum Beispill, an engem 20μl qPCR System, addéiere 2-6 μl Lysisbuffer, awer net méi wéi 6 μl.

2.D'Optimisatioun gutt qPCR Konditiounen (Annealing Temperatur, etc.) fir qPCR Reaktioun (D'Reaktioun Konditiounen op Table 3-2 uginn).

Notiz: Probéiert optimiséiert Konditioune fir qPCR Reaktiounen ze benotzen fir besser Resultater ze kréien.

Dësch 3-1: Virbereedung vun PCR Reaktioun System

1 *: Primer Konzentratioun kann am Beräich vun 50-900 nM ugepasst ginn wann Primer Reaktioun Leeschtung schlecht ass.

Notiz: De qPCR System kann no experimentellen Bedierfnesser a Fluoreszenz Cycler Modell ugepasst ginn.Fir qPCR an engem 50μl System, passt d'Reagensdoséierung proportional un no dem 20μl system.

2*: Wielt déi entspriechend Finale Konzentratioun vum ROX Referenz Dye no der Fluoreszenz quantitativen thermesche Cycler.Déi gëeegentste ROX Referenz Dye Konzentratioune fir allgemeng Fluoreszenz quantitative Cycler ginn an der Tabell hei ënnen gewisen:

Dësch 3-2: qPCR Reaktioun Konditiounen sinn gëtt

Notiz: Fir de beschten qPCR Effekt ze kréien, kann Gradient PCR benotzt ginn fir d'Reaktiounsbedéngungen fir verschidde Templates a verschidde Primer ze optimiséieren.PCR Reaktioun Konditiounen variéieren jee no der fluorescence Analyser, Schabloun, primer, etc.. An der spezifesch Operatioun, déi optimal Reaktioun Konditiounen mussen no de spezifesche Konditiounen vun der fluorescence quantitativ thermesch Cycler entworf ginn, Schabloun Typ, Gréisst vun der Fragment vun Interessi, Basis Haaptrei vun der amplified Fragment an GC Inhalt an Längt vun primers, dorënner Reaktiounszäit annealing Temperatur, etc.

Real Time PCR Primer Design Prinzipien

Forward Primer a Reverse Primer

Fir Real Time PCR ass Primer Design ganz wichteg.Primer si mat der Spezifizitéit an der Effizienz vun der PCR Amplifikatioun verbonnen, a kënne mat Referenz op déi folgend Prinzipien entworf ginn:

◆ Primer Längt: 18-30bp.

◆ GC Inhalt: 40-60%.

◆ Tm Wäert: Primer Design Software, wéi Primer 5, kann den Tm Wäert vum Primer ginn.D'Tm Wäerter vun den Upstream an Downstream Primer solle sou no wéi méiglech sinn.D'Tm Berechnungsformel kann och benotzt ginn: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Wann Dir PCR ausféiert, gëtt eng Temperatur ënner dem Primer Tm Wäert vu 5 ° C allgemeng als d'Annealtemperatur ausgewielt (déi entspriechend Erhéijung vun der annealing Temperatur kann d'Spezifizitéit vun der PCR Reaktioun erhéijen).

◆ Primer a PCR Produkter:

◆ Design Primer PCR Amplifikatioun Produktlängt ass am léifsten 100-150bp.

◆ Designprimer am sekundäre strukturelle Gebitt vun der Schabloun solle sou vill wéi méiglech vermeit ginn.

◆ Vermeit d'Bildung vun 2 oder méi komplementäre Basen tëscht den 3' Enden vun Upstream an Downstream Primer.

◆ Primer 3′ Terminal Basis kann net mat 3 zousätzlech konsekutiv G oder C präsent sinn.

◆ D'Primer selwer kënnen net komplementär Strukturen hunn, soss gëtt eng Haarnadelstruktur geformt, déi PCR Amplifikatioun beaflosst.

◆ ATCG soll esou gläichméisseg wéi méiglech an der Primer Sequenz verdeelt ginn, an d'3'Terminalbasis soll als T vermeit ginn.

Anhang1:Cell direktRT-qPCR Kit Komponentet Zousaz Pak

1.Zell Lysis Léisung