1. Éischt Versteesdemech
Op dëser Etapp musse mir e puer Konzepter an Terminologie verstoen, fir ze vermeiden Feeler virun eise Senioren ze maachen, wéi:
Q: Wat ass den Ënnerscheed tëscht RT-PCR, qPCR, Echtzäit PCR, an Echtzäit RT-PCR?
Äntwert: RT-PCR ass ëmgedréint Transkriptiouns PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), wat eng wäit benotzt Variant vun der Polymerase Kettenreaktioun (PCR) ass.Am RT-PCR gëtt eng RNA Strang ëmgedréint an komplementär DNA transkribéiert, déi dann als Schabloun fir DNA Amplifikatioun duerch PCR benotzt gëtt.
Echtzäit-PCR an qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) sinn déi selwecht Saach, béid sinn real-Zäit quantitativ PCR, dat heescht, datt all Zyklus vun PCR Echtzäit Daten records huet, sou kann d'Zuel vun Start Schablounen präzis Analyse ugepasst ginn.
Och wa béid Echtzäit PCR (Echtzäit fluoreszent quantitativ PCR) a Reverse Transkriptioun PCR (Reverse Transcription PCR) als RT-PCR verkierzt schéngen, ass déi international Konventioun: RT-PCR bezitt sech speziell op ëmgedréint TranskriptiounPCR, Echtzäit PCR gëtt allgemeng als qPCR (quantitativ Echtzäit PCR) verkierzt..
An Echtzäit RT-PCR (RT-qPCR), Et ass de Reverse Transkriptiouns PCR kombinéiert mat der fluoreszenter quantitativer Technologie: kritt als éischt cDNA (RT) vun der RNA ëmgedréint Transkriptioun, a benotzt dann Echtzäit PCR fir quantitativ Analyse (qPCR).Déi meescht Laboratoiren maachen RT-qPCR, dat heescht Fuerschung iwwer RNA Ausdrock Down-Regulatioun, sou datt de qPCR, deen jiddereen am Labo schwätzt, bezitt sech eigentlech op RT-qPCR, awer vergiesst net datt et nach ëmmer vill DNA Tester a klineschen Uwendungen sinn.Quantitativ Analyse, wéi Hepatitis B Virus HBV Detektioun.
Fro: Nodeems Dir vill fluoreszent quantitativ PCR gelies hutt, firwat sollt dat amplifizéiert Fragment am Beräich vun 80-300bp kontrolléiert ginn?
Äntwert: D'Längt vun all Gen Sequenz ass anescht, e puer sinn e puer kb, e puer sinn Honnerte vu bp, awer mir brauche just d'Produktlängt ze erfuerderen 80-300bp wann Dir Primer designt, ze kuerz oder ze laang sinn net gëeegent fir fluoreszent quantitativ PCR Detektioun.D'Produktfragment ass ze kuerz fir vum Primer-Dimer z'ënnerscheeden.D'Längt vum Primer-Dimer ass ongeféier 30-40bp, an et ass schwéier z'ënnerscheeden ob et e Primer-Dimer ass oder e Produkt wann et manner wéi 80bp ass.Wann d'Produktfragment ze laang ass, méi wéi 300bp, wäert et einfach zu enger gerénger Amplifikatiounseffizienz féieren a kann net effektiv d'Quantitéit vum Gen erkennen.
Zum Beispill, wann Dir zielt wéivill Leit an engem Klassesall sinn, musst Dir nëmmen zielen wéivill Mond et sinn.Datselwecht ass wouer wann Dir Genen erkennt, Dir braucht nëmmen eng gewësse Sequenz vun engem Gen z'entdecken fir ze representéieren Déi ganz Sequenz wäert maachen.Wann Dir Leit wëllt zielen, musst Dir souwuel de Mond an d'Nues, d'Oueren an d'Brëll zielen, an et ass einfach Feeler ze maachen.
Fir auszebauen, an der biologescher Fuerschung, ginn et vill Fuerschungsfäll vu Punkt zu Gebitt, well d'Gensekvens vun all Spezies ganz laang ass, ass et onnéideg an onméiglech all Fragmenter ze moossen, sou wéi bakteriell 16S Sequenzéierung, déi d'konservativ Sequenz vu Bakterien assays ausféieren fir d'Zuel vun enger bestëmmter Populatioun vu Bakterien ofzeschléissen.
Q: Wat ass déi optimal Längt fir qPCR Primer Design?
Äntwert: Allgemeng ass d'Primerlängt ongeféier 20-24bp, wat besser ass.Natierlech musse mir op den TM Wäert vum Primer oppassen wann Dir de Primer designt, well dëst mat der optimaler Glühungstemperatur verbonnen ass.No villen Experimenter gouf bewisen datt 60°C e besseren TM Wäert ass.Wann d'annealing Temperatur ze niddreg ass, wäert et einfach zu net spezifesch amplification Féierung.Wann d'Annealtemperatur ze héich ass, wäert d'Verstäerkungseffizienz relativ niddereg sinn, de Peak vun der Verstäerkungskurve fänkt méi spéit un, an de CT-Wäert gëtt verspéit.
Q: Wéi ass d'Faarfmethod anescht wéi d'Sondemethod?
Äntwert: Dye MethodE puer fluoreszent Faarfstoffer, wéi SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., emittéieren net eleng Liicht, awer emittéieren Fluoreszenz no der Bindung un déi kleng Groove vun duebelstrengend DNA.Dofir, am Ufank vun der PCR Reaktioun, kann d'Maschinn net de fluoreszent Signal erkennen.Wann d'Reaktioun d'Annealing-Extensiounsstadium erreecht, gëtt den Duebelstrang opgemaach, an en neie Strang gëtt ënner der Handlung vun DNA Polymerase synthetiséiert, an de fluoreszent Molekül bindt sech un d'dsDNA Minor Groove.Wéi d'Zuel vu PCR-Zyklen eropgeet, ginn ëmmer méi Faarfstoffer mat duebelstrengegen DNA kombinéiert, an de fluoreszent Signal gëtt och kontinuéierlech verbessert.D'Faarfmethod gëtt haaptsächlech an der wëssenschaftlecher Fuerschung benotzt.
PS: Sidd virsiichteg wann Dir den Experiment maacht, de Faarfstoff muss mat mënschlecher DNA kombinéiert ginn, passt op datt et zu enger fluoreszenter Persoun gëtt.
Dye Method (lénks) Sonde Method (riets)
PS: Sidd virsiichteg wann Dir den Experiment maacht, de Faarfstoff muss mat mënschlecher DNA kombinéiert ginn, passt op datt et zu enger fluoreszenter Persoun gëtt.
SYBR Green Ⅰ bindt sech un déi kleng Groove vun der DNA
Probe MethodTaqman Sonde ass déi meescht benotzt Hydrolyse Sonde.Et gëtt eng fluoreszent Grupp um 5′ Enn vun der Sonde, normalerweis FAM, an d'Sonde selwer ass eng Sequenz komplementar zum Zilgen.Et gëtt eng fluoreszent Quenching Grupp um 3′ Enn.No dem Prinzip vun der Fluoreszenz Resonanz Energie Transfert (Förster Resonanz Energie Transfert, FRET), wann d'Reporter fluorescent Grupp (Spender fluorescent Molekül) an der quenching fluorescent Grupp (Acceptor fluorescent Molekül) sinn opgereegt Wann d'Spektra iwwerlappt an d'Distanz ass ganz no (7-10 Molekülle vun der fluorescerende Can) den Akzeptormolekül, während d'Autofluoreszenz geschwächt ass.Dofir, am Ufank vun der PCR Reaktioun, wann d'Sond fräi an intakt am System ass, wäert d'Reporter fluoreszent Grupp keng Fluoreszenz emittéieren.Beim annealing binden de Primer an d'Sonde un d'Schabloun.Wärend der Verlängerungsstadium synthetiséiert d'Polymerase kontinuéierlech nei Ketten.DNA Polymerase huet 5′-3′ Exonuklease Aktivitéit.Wann d'Sonde erreecht gëtt, wäert d'DNA-Polymerase d'Sond aus der Schabloun hydrolyséieren, d'Reporter-Fluoreszent-Grupp vun der Quencher-Fluoreszent-Grupp trennen an de fluoreszent Signal fräiginn.Well et eng een-zu-een Relatioun tëscht der Sonde an der Schabloun ass, ass d'Sondemethod superieur wéi d'Faarfmethod wat d'Genauegkeet an d'Sensibilitéit vum Test ugeet.D'Sondemethod gëtt haaptsächlech an der Diagnostik benotzt.
Q: Wat ass absolute Quantifikatioun?Wat ass Relativ Quantifikatioun?
Äntwert: Absolute Quantifikatioun bezitt sech op d'Berechnung vun der initialer Kopienummer vun der Probe, déi duerch qPCR getest gëtt, sou wéi vill HBV-Viren an 1ml Blutt sinn.D'Resultat kritt duerch relativ Quantifizéierung ass d'Ännerung vum Betrag vum Zilgen an enger spezifescher Probe relativ zu enger anerer Referenzprobe, an den Genausdrock ass up-reguléiert oder down-reguléiert.
Q: Wäert d'Quantitéit vun der RNA Extraktioun, ëmgedréint Transkriptiounseffizienz, an Amplifikatiounseffizienz d'experimentell Resultater beaflossen?
Q: Wäert Probespäicherung, Extraktiounsreagenz, ëmgedréint Transkriptiounsreagenz, a Liichtiwwerdroende Verbrauchsmaterial d'experimentell Resultater beaflossen?
Q: Wéi eng Method kann d'experimentell Donnéeën korrigéieren?
Wat dës Themen ugeet, wäerte mir se am Detail an de fortgeschrattenen an erweiderten Sektiounen hei ënnen beschreiwen.
2. Fortgeschratt Wëssen
Wat d'Echtzäit fluoreszent quantitativ PCR ugeet, musse mir d'Realitéit erkennen datt Dausende vu wëssenschaftleche Fuerschungsaarbechte all Joer publizéiert ginn, dorënner déi fluoreszent quantitativ PCR Technologie net eng kleng Zuel ass.
Wann et kee gemeinsame Standard gëtt fir de fluoreszent quantitative PCR Experiment ze moossen, kënnen d'Resultater vill variéieren.Fir dee selwechte Gen vun der selwechter Spezies, mat der selwechter Veraarbechtungsmethod, wäerten d'Erkennungsresultater och vill variéieren, an et wäert schwiereg sinn fir spéider déi selwecht Resultater ze widderhuelen.Dir Kee weess wat richteg ass a wat falsch ass.
Heescht dat datt fluoreszent quantitativ PCR eng Cheat Technologie oder eng onzouverlässeg Technologie ass?Nee, et ass well fluorescent quantitative PCR méi sensibel a méi präzis ass, an e bësse falsch Operatioun wäert komplett entgéintgesate Resultater produzéieren.E klenge Verloscht ass dausend Meilen ewech.Den Auteur vum Artikel kann ëmmer erëm vun de Rezensiounen gefoltert ginn.Zur selwechter Zäit sinn d'Rezensiounen vum Journal och schwéier aus verschiddenen experimentellen Resultater ze wielen.
Alles an allem, weist op e Mangel u Konsens an Echtzäit PCR Experimenter.Zu dësem Zweck hunn Senior Wëssenschaftler an der Industrie ugefaang Standarden ze formuléieren,Verlaangt datt d'Bäiträg e puer néideg experimentell an Datenveraarbechtungsdetailer (inklusiv néideg Donnéeën) am Artikel ubidden fir dës Normen z'erreechen.
Bewäertungen kënnen d'Qualitéit vum Experiment beurteelen andeems Dir dës Detailer liest;zukünfteg Lieser kënnen dat och benotze fir d'Experiment ze widderhuelen oder d'Experiment ze verbesseren.Dann sinn déi experimentell Resultater op dës Manéier voller Informatioun, héichqualitativ a benotzbar.
MIBBI (Minimum Informatioun fir Biologesch a Biomedizinesch Ermëttlungen -http://www.mibbi.org) entstanen ass.MIBBI ass e Projet dee Standarde fir Experimenter ubitt.Et ass an der Natur publizéiert.Dëse Projet riicht sech op verschidde biologesch Experimenter, dorënner Zellbiologie, Microarray, qPCR, déi mir elo diskutéieren, etc., a suergt fir all Typ vun Experimenter wann Dir Manuskripter ofginn.Dës Informatioun soll zu all Moment geliwwert ginn.
Am MIBBI Projet ginn et zwee Artikelen am Zesummenhang mat fluoreszent quantitativen PCR, nämlech:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - e strukturéierte Sprooch- a Berichterstattungsguide fir Echtzäit quantitativ PCR-Daten;
·MIQE (Minimum Informatioun fir Verëffentlechung vu quantitativen Echtzäit PCR Experimenter) - Minimum Informatioun fir Artikelen iwwer Echtzäit quantitativ PCR Experimenter ze publizéieren.
Als éischt schwätze mer iwwer RDML, d'Terminologie Spezifizéierung.
Wann et keng Standarddefinitioun fir alles gëtt, ass et onméiglech d'Diskussioun weiderzemaachen, dofir ass d'Erklärung vun de Begrëffer sou wichteg am Examen.
D'Terminologie, déi am fluoreszent quantitativen PCR Experiment benotzt gëtt, enthält de folgenden Inhalt.QIAGEN huet de beschte Resumé fir eis gemaach.Déi folgend sinn all dréchenWueren .
Amplifikatiounskurve
D'Verstäerkungskurve bezitt sech op d'Kurve, déi während dem PCR-Prozess gemaach gouf, mat der Zyklusnummer als Abscissa an der Echtzäit Fluoreszenzintensitéit wärend der Reaktioun als Ordinat.
Eng exzellent Verstäerkungskurve soll déi folgend Charakteristiken hunn: d'Basislinn ass flaach oder liicht erofgaang, an et gëtt keen offensichtlechen Upward Trend;den Inflektiounspunkt vun der Kurve ass kloer, an den Hang vun der exponentieller Phase ass proportional zu der Verstärkungseffizienz.Wat den Hang méi grouss ass, wat méi héich d'Verstäerkungseffizienz;déi allgemeng Verstäerkungskurve De Parallelismus ass gutt, wat beweist datt d'Verstäerkungseffizienz vun all Röhre ähnlech ass;d'exponentiell Phase vun der Amplifikatiounskurve vun niddereg-Konzentratioun Echantillon ass offensichtlech.
Baseline (Baseline)
D'Basislinn ass de Kaméidiniveau vum fréien Zyklus, normalerweis tëscht dem 3. an dem 15. Zyklus gemooss ginn, well d'Fluoreszenzwäerterhéijung, déi duerch d'Verstäerkungsprodukt verursaacht gëtt, während dëser Period net erkannt ka ginn.D'Zuel vun den Zyklen, déi benotzt gi fir d'Basislinn ze berechnen, kënne variéiert ginn a musse reduzéiert ginn wann héich Schablounbetrag benotzt ginn oder wann den Ausdrockniveau vum Zilgen héich ass.
D'Basislinn setzen erfuerdert d'Fluoreszenzdaten vun der Linearitéitsverstärkungskurve ze gesinn.D'Basislinn ass sou gesat datt de Wuesstum vun der Amplifikatiounskurve mat enger Zyklusnummer méi grouss ass wéi d'Basiszyklus Topnummer.Baselines mussen individuell fir all Zilsequenz festgeluecht ginn.Déi duerchschnëttlech Fluoreszenzwäerter, déi an de fréie Zyklen festgestallt goufen, musse vun de Fluoreszenzwäerter subtrahéiert ginn, déi an de verstäerkte Produkter kritt goufen.Déi lescht Versioune vu verschiddenen Echtzäit PCR Software erlaben automatesch Optimiséierung vun de Baseline Astellunge fir eenzel Proben.
Wärend den éischte puer Zyklen vun der PCR Amplifikatiounsreaktioun ännert sech de Fluoreszenzsignal net vill.Eng riicht Linn Approche gëtt d'Basislinn genannt, awer wa mir déi éischt Zyklen genau kucken, gesi mir datt bannent der Basislinn ass wat an der Foto hei drënner geschitt.
Hannergrond Hannergrond bezitt sech op
den net spezifesche Fluoreszenzwäert an der Reaktioun.Zum Beispill: ineffizient Fluoreszenz-Quenching;oder eng grouss Zuel vun duebel-stranded DNA Schablounen wéinst der Benotzung vun SYBR Green.D'Hannergrond Komponente vum Signal gi mathematesch vum Real-Time PCR Software Algorithmus geläscht.
Reporter Signal
Reporter Signal bezitt sech op de fluoreszent Signal generéiert vun SYBR Green oder fluorescently markéiert Sequenz-spezifesch Sonden während Real-Time PCR.
Normaliséiert Reporter Signal (RN)
RN bezitt sech op d'Fluoreszenzintensitéit vum Reporterfaarf gedeelt duerch d'Fluoreszenzintensitéit vum passive Referenzfaarf gemooss bei all Zyklus.
Passiv Referenz Dye
An e puer Echtzäit PCRs,de fluorescent Faarfstoff ROX gëtt als intern Referenz benotzt fir de fluoreszent Signal ze normaliséieren.Et korrigéiert fir Variatiounen wéinst ongenau Pipetting, Well Positioun, a Fluoreszenz Schwankungen op eng gutt-vun-gutt Basis.
Fluoreszenzschwell (Schwell)
gouf iwwer den Hannergrondwäert ugepasst a wesentlech ënner dem Plateauwäert vun der Amplifikatiounskurve.Et muss an der linearer Regioun vun der Amplifikatiounskurve leien, déi de log-lineare Beräich vun der PCR Detektioun representéiert.D'Schwelle sollen an der Log-Verstäerkungskurvevisioun festgeluegt ginn, sou datt d'Log-linear Phase vum PCR liicht erkennbar ass.Wann et méi Zilgenen an Echtzäit PCR sinn, muss d'Schwell fir all Zil gesat ginn.Allgemeng gëtt de Fluoreszenzsignal vun den éischten 15 Zyklen vun der PCR Reaktioun als Fluoreszenzhannergrondsignal benotzt, an de Fluoreszenzschwell ass 10 Mol d'Standardabweichung vum Fluoreszenzsignal vun den éischten 3 bis 15 Zyklen vu PCR, an d'Fluoreszenzschwell ass an der PCR Amplifikatiounsphase gesat.Allgemeng huet all Instrument seng Fluoreszenzschwell virum Gebrauch festgeluecht.
Cycle Threshold (CT) oder Crossing Point (CP)
Den Zyklus bei deem d'Verstäerkungskurve d'Schwell iwwerschreift (dh de Punkt op deem d'Fluoreszenzerkennung wesentlech eropgeet).CT kann eng Fraktioun sinn an de Betrag vun der Startschabloun kann berechent ginn.Den CT Wäert representéiert d'Zuel vun den Zyklen déi erlieft ginn wann de fluoreszent Signal an all PCR Reaktiounsröhre de festgeluegte Schwell erreecht.Et gëtt eng linear Relatioun tëscht dem CT Wäert vun all Schabloun an dem Logarithmus vun der initialer Kopienummer vun der Schabloun, denméi héich d'initial Kopie Zuel, déi méi kleng den CT Wäert, a vice versa.Eng Standardkurve kann gemaach ginn andeems Dir e Standard mat enger bekannter initialer Kopienummer benotzt, wou d'Abscissa den CT Wäert duerstellt, an d'Ordinate de Logarithmus vun der initialer Kopienummer duerstellt.Dofir, soulaang de CT-Wäert vun der onbekannter Probe kritt gëtt, kann d'initial Kopienummer vun der Probe aus der Standardkurve berechent ginn.
ΔCT Wäert
ΔCT Wäert beschreiftden Ënnerscheed tëscht der Zil- Gen an der entspriechend endogenous Referenz Gen CT Wäert, sou wéi en Haushaltsgen, a gëtt benotzt fir d'Quantitéit vun der Schabloun ze normaliséieren déi benotzt gëtt:
⇒ΔCT = CT (Zielgen) - CT (endogen Referenzgen)
ΔΔCT Wäert
Den ΔΔCT Wäert beschreift den Ënnerscheed tëscht dem mëttleren ΔΔCT Wäert vun enger Probe vun Interesse (zB stimuléiert Zellen) an dem mëttleren ΔΔCT Wäert vun enger Referenzprobe (zB onstimuléiert Zellen).D'Referenzprobe gëtt och d'Kalibrierungsprobe genannt an all aner Proben ginn op dës fir eng relativ Quantifikatioun normaliséiert:
⇒ΔΔCT = Moyenne ΔCT (Probe vun Interesse) - Moyenne ΔCT (Referenz Echantillon)
Endogene Referenzgenen (endogen Referenzgenen)
D'Ausdrock Niveauen vun endogenous Referenz Genen, wéi housekeeping Genen (housekeeping Genen), ënnerscheeden net tëscht Echantillon.D'CT Wäerter vum Referenzgen mam Zilgen ze vergläichen erlaabt den Ausdrockniveau vum Zilgen op d'Quantitéit vun Input RNA oder cDNA normaliséiert ze ginn (kuckt d'Sektioun iwwer ΔCT Wäerter uewen).
Intern Referenz Genen korrekt firméiglech RNA Degradatioun oder d'Präsenz vun Enzyminhibitoren an RNA Echantillon, souwéi Variatiounen am RNA Inhalt, ëmgedréint Transkriptiounseffizienz, Nukleinsäure Erhuelung a Probehandhabung.Fir déi optimal Referenz Gen (en) auswielen, hu mir den Algorithmus geännert fir seng Auswiel vun der optimaler Referenz ofhängeg vum experimentellen Kader z'erméiglechen.
Intern Kontroll
Eng Kontrollsequenz déi an der selwechter Reaktioun wéi d'Zielsequenz verstäerkt gëtt a mat enger anerer Sonde gepréift gëtt (dh Duplex PCR ausféieren).Intern Kontrolle ginn dacks benotzt fir gescheitert Amplifikatiounen auszeschléissen, sou wéi wann d'Zielsequenz net erkannt gëtt.
Eechung Sample
Eng Referenzprobe (zum Beispill gereinegt RNA vun enger Zelllinn oder Tissu) benotzt an der relativer Quantifizéierung fir all aner Proben ze vergläichen fir de relativen Ausdrockniveau vun engem Gen ze bestëmmen.D'Kalibrierungsprobe kann all Probe sinn, awer ass normalerweis eng Kontroll (zum Beispill eng onbehandelt Probe oder eng Probe vun der Zäit Null vum Experiment).
Positiv Kontrollen
benotzen Kontroll Reaktioune matbekannt Quantitéiten vun Schabloun.Positiv Kontrolle ginn dacks benotzt fir ze kontrolléieren ob e Primer-Set oder e Primer-Sonde-Set richteg funktionnéiert an datt d'Reaktioun richteg ageriicht ass.
Keng Schabloun Kontroll (NTC)
Eng Kontrollreaktioun déi all déi néideg Komponente vun der Amplifikatiounsreaktioun enthält ausser d'Schabloun, déi normalerweis mat Waasser ersat gëtt.D'Benotzung vun NTC kann d'Kontaminatioun fannen, déi duerch Reagenskontaminatioun oder auslännesch DNA verursaacht gëtt, sou datt d'Authentizitéit an d'Zouverlässegkeet vun den Detektiounsdaten assuréiert.Amplifikatioun vun der NTC Kontroll weist Kontaminatioun un.
Keng RT Kontroll (NRT)
De RNA Extraktiounsprozess kann duerchschnëttlech genomesch DNA enthalen, wat extrem schiedlech ass an den Täter ass deen d'Datequalitéit an den natierleche Feind vum qPCR beaflosst, also wann Dir Experimenter designt, muss et entworf ginn fir nëmmen d'RNA Detektioun ze verstäerken.Et ginn zwou Méiglechkeeten, een ass d'Primeren iwwer Intronen ze designen, déi aner ass d'DNA komplett ze läschen, wat een ass besser, wat méi spéit diskutéiert gëtt.D'NTR Kontroll ass e magesche Spigel fir DNA Verschmotzung z'entdecken.Wann et Verstäerkung ass, heescht et datt et Verschmotzung gëtt.
Standarden
Standarde si Proben vu bekannter Konzentratioun oder Kopienummer déi benotzt gi fir eng Standardkurve ze bauen.Fir d'Stabilitéit vum Standard ze garantéieren, gëtt d'Genfragment normalerweis an de Plasmid gekloont an als Standard benotzt.
Standard Curve
gëtt normalerweis an op d'mannst 5 Konzentratiounsgradienten mat dem Standardprodukt no dem Verdueblungsverhältnis verdünnt, a 5 Punkte ginn an de Koordinaten vum CT-Wäert a Kopienummer gezeechent, an d'Punkte si verbonne fir eng Linn ze bilden fir eng Standardkurve ze generéieren.Fir all Standardkurve muss seng Validitéit iwwerpréift ginn.Den Steigungswäert fällt tëscht -3,3 an -3,8, an all Konzentratioun gëtt an triplicate gemaach.Punkten déi wesentlech vun anere Punkten ënnerscheeden, solle verworf ginn.Den CT Wäert vun der Probe fir ze testen gëtt an d'Standardkurve bruecht, an den Ausdrockniveau vun der Probe fir ze testen kann berechent ginn.
Den CT Wäert vun der Probe fir ze testen gëtt an d'Standardkurve bruecht, an déi initial Kopienummer vun der Probe fir ze testen kann berechent ginn.
Effizienz an Steigungen
Den Hang vun der Standardkurve representéiert d'Effizienz vun Echtzäit PCR.
· En Hang vun -3.322 weist datt d'PCR Verstärkungseffizienz 1 ass, oder 100% effizient, an d'Quantitéit vum PCR Produkt verduebelt bei all Zyklus.
·En Hang manner wéi -3.322 (zB -3.8) weist eng PCR Effizienz un
· En Hang méi grouss wéi -3.322 (zB -3.0) weist datt d'PCR-Effizienz méi wéi 100% schéngt, wat virwëtzeg ass, wéi kéint een Zyklus vu PCR méi wéi duebel dat amplifizéiert Produkt generéieren?Dës Situatioun geschitt an der net-linearer Phase vun der PCR Reaktioun, dat heescht, et gëtt eng grouss Quantitéit vun net spezifescher Amplifikatioun.
Schmelzkurve
Nodeems d'qPCR Amplifikatioun fäerdeg ass, gëtt de PCR Produkt erhëtzt.Wéi d'Temperatur eropgeet, schmëlzt dat duebelstrengend Amplifikatiounsprodukt graduell, wat zu enger Ofsenkung vun der Fluoreszenzintensitéit resultéiert.Wann eng gewëssen Temperatur (Tm) erreecht gëtt, schmëlzt eng grouss Zuel vu Produkter.Fluoreszenz fällt staark.Verschidde PCR Produkter hunn ënnerschiddlech Tm Wäerter a verschidde Schmelztemperaturen, sou datt d'Spezifizitéit vum PCR identifizéiert ka ginn.
Schmelzkurve (Derivatkurve)
D'Schmelzkurve gëtt ofgeleet fir eng Peakkaart ze bilden, déi d'Situatioun vu PCR Produktfragmenter méi intuitiv ka weisen.Well d'Schmelztemperatur den Tm-Wäert vum DNA-Fragment ass, kënnen e puer Parameteren, déi den Tm-Wäert vum DNA-Fragment beaflossen, beurteelt ginn, wéi Fragmentgréisst, GC-Inhalt, asw.d'Längt vum verstäerkte Produkt ass am Beräich vun 80-300bp, sou datt d'Schmelztemperatur tëscht 80°C an 90°C soll sinn.
Interpretatioun vun der Schmelzkurve: Wann den eenzegen Haaptpeak tëscht 80°C-90°C erschéngt, heescht et datt de fluoreszent quantitativen PCR perfekt ass;wann den Haaptpeak erschéngt tëscht 80 ° C-90 ° C an verschidde Peaks ënner 80 ° C erschéngen, gëtt de Primer Dimer am Fong berücksichtegt.Dir kënnt probéieren d'Annealtemperatur ze erhéijen fir se ze léisen;wann den Haaptpeak erschéngt tëscht 80 ° C-90 ° C, an de verschiddenen Héichpunkt erschéngt erëm wann d'Temperatur eropgeet, gëtt am Fong berücksichtegt datt et DNA Kontaminatioun ass, an DNA muss an der éischter Etapp vum Experiment geläscht ginn.
Natierlech ginn et nach e puer anormal Situatiounen, déi hei ënnen een nom aneren opgedeelt ginn.
3. Fortgeschratt Wëssen
Fir qPCR ze maachen, muss ech MIQE soen,Minimum Informatiounenfir Publikatioun vunQuantitativEchtzäit PCRExperimenter - de Minimum Informatioun fir Artikelen iwwer Echtzäit quantitative PCR ze publizéierenExperimenter.Fir jidderengem säi Verständnis ze vereinfachen, wäerte mir de Schlësselinhalt vereinfachen.
Dir kënnt d'Original Text vun MIQE um Internet Sich, an déi wichtegst Saach ass, datt et derdaten Checklëscht déi muss ginn, wann en Artikel publizéiert .
Bewäertungen kënnen d'Qualitéit vum Experiment beurteelen andeems Dir dës Detailer liest;zukünfteg Lieser kënnen dëst och benotze fir d'Experiment ze widderhuelen oder ze verbesseren.
Et ass derwäert ze notéieren datt an dëser Lëscht d'Wichtegkeet vun all Lëscht mat E oder D respektiv markéiert ass.Wat heescht dat?E: essentiel Informatioun (muss presentéiert ginn);D: wënschenswäert Informatioun (sou vill wéi méiglech ubidden).
MIQE (1) - Experimentell Design
Vill Scumbags, déi hir Verteidegung ofgeschloss hunn nodeems se hir Graduéierter Studien ofgeschloss hunn, wësse net wéi een en Experiment onofhängeg designt, hir Notizbicher opmaachen a maachen wat den Enseignant hinnen seet.Als Resultat war den experimentellen Design net rigoréis, an d'Redaktioun vum Magazin huet gesot datt si dëst Bild an dat Bild wollte maachen, also hunn se et an engem Dämmerung gemaach.Dëst ass wéi d'Schaubercher gemaach ginn!
Méi no doheem ass den éischte Prinzip vum Experiment ze bestëmmend'Strengheet vun der experimenteller Logik.Déi fundamentalst Saach ass den experimentellen Design, an déi wichtegst Saach iwwer den experimentellen Design ass wéi d'Zilprobe, d'Referenzprobe (Kontroll) an d'Zuel vun de Widderhuelunge gesat gëtt, sou datt d'experimentell Daten referenzéiert, vergläichbar an iwwerzeegend kënne ginn.
Zil Proufbezitt sech op d'Probe déi eis erfuerdert den Zilgen no enger bestëmmter Behandlung z'entdecken.D'Referenz Echantillonass d'Probe ouni Behandlung, déi an der Biologie dacks als Wildtyp bezeechent gëtt.
Experimentell replizéiertsi ganz wichteg.Allgemeng muss d'Zuel vun iwwerzeegend Replikate méi wéi dräi sinn.Et ass néideg ze z'ënnerscheeden wat biologesch Replikatioun ass a wat technesch Replikatioun ass.
Biologesch Replikate: Datselwecht Verifizéierungsexperiment gemaach mat verschiddene Materialien (Zäit, Planzen, Chargen, Reaktiounsplacken).
Biologesch Duplikatioun
Loosst eis d'Pestizidbehandlung vu Peffer als Beispill huelen.Mir wëllen Pestiziden op déi dräi Planzen vun ABC sprëtzen, dann sinn déi dräi Planzen vun ABC dräi biologesch Replikate, a si sinn datselwecht Verifizéierungsexperiment mat verschiddene Materialien.Awer als Experiment ass definitiv eng Kontroll gebraucht, sou datt mir eng vun de Branchen vun der Planz A sprëtzen fir eng experimentell Grupp vun der Planz A ze bilden, an net déi aner Branchen vun der Planz A sprëtzen fir eng Kontrollgruppe ze bilden.Maacht datselwecht fir B an C.
Technesch Replikate (Technesch Replikater): Et ass e widderholl Experiment entworf fir Feeler ze vermeiden, déi duerch Operatioun verursaacht ginn, wat tatsächlech en Duplikat Lach ass am selwechte Material abegraff.Béid Behandlungen a Kontrolle musse replizéiert Astellunge (minimum dräi) vum Zilgen an dem internen Referenzgen hunn.
Technesch Widderhuelung
Huelt nach eng Kéier de mat Pestiziden behandelt Peffer als Beispill.Fir d'experimentell Grupp vun Planz A, hu mir dräi PCR Lächer vun 1 gemaach, 2, an 3 fir seng Zil- Gen an intern Referenz Gen respektiv, sou wéi d'Moyenne no der Detektioun ze huelen.Fir d'Kontroll vun Planz A Gruppen sinn och an déi selwecht Manéier behandelt.Ähnlech maachen déiselwecht Behandlung fir B- a C-Planzen.Dëst ass technesch Widderhuelung.
Et ass derwäert opgeschriwwen dasswat an d'Statistik erakënnt ass déi biologesch Widderhuelung, an déi technesch Widderhuelung ass fir ze testen ob et zoufälleg Phänomener am experimentellen Prozess sinn, fir datt d'Experimenter Resultater glafwierdeg maachen, dat heescht Feeler ze vermeiden andeems se hiren Duerchschnëtt huelen wéi mir dacks soen.
Negativ Kontrollen - NTC an NRT
NTC (No-Template Control), eng Kontroll ouni Schabloun, gëtt benotzt fir z'iwwerpréiwen ob dat experimentellt Material kontaminéiert ass.Allgemeng gëtt Waasser als Schabloun benotzt.Wann et eng fluoreszent Reaktioun ass, weist et datt d'Nukleinsäurekontaminatioun am Laboratoire geschitt ass.
Dës Pollutioune kommen aus: onreint Waasser, onqualifizéiert Reagenz mat endogene DNA, Primerverschmotzung, Laboausrüstungsverschmotzung, Aerosolverschmotzung, etc., musse RNase Scavengers an RNase Inhibitoren benotzen.Aerosol Verschmotzung ass déi schwéierst ze fannen.Stellt Iech vir datt Äre Laboratoire wéi Smog ass, mat verschiddenen Nukleinsäuren an der Loft suspendéiert.
NRT (No-Reverse Transcriptase), d'Kontroll ouni ëmgedréint Transkriptioun, ass déi net ëmgedréint transkribéiert RNA als negativ Kontroll, wat d'Kontroll vu gDNA Rescht ass.
Wann Dir Genausdrock mécht, gëtt d'Quantitéit u RNA festgestallt andeems d'Quantitéit vun cDNA no ëmgedréint Transkriptioun erkannt gëtt.Wann et gDNA Rescht ass wann RNA gereinegt gëtt, wäert et Feeler an den experimentellen Resultater verursaachen, well déi tatsächlech Resultater kritt gDNA an cDNA sinn.Um aggregéierten Niveau, net nëmmen cDNA, muss gDNA wärend der RNA Extraktioun komplett geläscht ginn.
MIQE (2) - Probeinformatioun
Déi sougenannte Probeinformatioun bedeit datt wa mir en Artikel iwwer qPCR publizéieren, musse mir d'Probeinformatioun kloer erklären, wat en onverzichtbaren Deel vum Artikel ass.Ähnlech, wa mir Proben veraarbechten, musse mir och eis eegen Operatiounen regléieren fir d'Validitéit vun de Proben ze garantéieren.
D'Beschreiwung vun der Probe ass nëmmen e Resultat, a mir sollten méi Opmierksamkeet op d'Materialien déi während dem ganzen Experiment geholl ginn.
Auswiel vun experimentellen Materialien
Bluttprouwen – wielt frësch Blutt, net méi wéi 4 Stonnen.Zell Echantillon - wielt frësch Zellen an enger Period vu kräftege Wuesstum ze sammelen.Déier Tissue - Wielt frësch, kräfteg wuessend Tissue.Planz Tissue - Wielt frësch, jonk Tissue.
Dir musst gemierkt hunn datt et e Schlësselwuert an dëse puer Sätz gëtt: frësch .
Fir déi uewe genannte Proben ass dee beschten, kosteneffizienten a stabile Kit um Maart de Foregene Kit, deen hir DNA an RNA séier an einfach extrahéiert.
Déier Total RNA Isolatioun Kit
Plant Total RNA Isolatioun Kit
Plant Total RNA Isolatioun Kit Plus
Lagerung vun experimentellen Materialien
Allgemeng empfeelen mir net Proben ze späicheren, wann d'Konditioune et erlaben.Wéi och ëmmer, et gi vill Frënn déi Experimenter net direkt no der Probe maachen kënnen, an e puer mussen souguer flësseg Stickstoffbehälter op d'Feld droen fir ze probéieren.
Fir dës Zort vun haart-schaffen Frënd, Ech kann nëmme soen, datt Dir net Reagenz consumables verstoen.Elo produzéiere vill reagens verbrauchbar Firmen Reagenzen déi RNA Echantillon bei Raumtemperatur späichere kënnen, an Dir kënnt wielen se ze benotzen.Déi konventionell Späichermethod ass flësseg Stickstofflagerung, mat engem klenge flëssege Stickstofftank deen einfach ze droen ass.Nodeems Dir d'Probe zréck an de Labo bruecht hutt, späichert se an engem -80 °C Frigo.
Fir Experimenter mat RNA, muss de sechs-Wuert Prinzip gefollegt ginn:niddereg Temperatur, keng Enzymen,anséier .
D'Konzept vun niddereg Temperatur ass einfach ze verstoen;ouni Enzymen, RNase ass iwwerall an der Welt an där mir liewen (soss wier Dir vun HIV ëmbruecht ginn), also wéi RNase ze vermeiden wann Experimenter maachen ass e ganz wichtegt Konzept;séier,Et gëtt kee Kung Fu op der Welt déi net gebrach ka ginn, nëmme Geschwindegkeet kann net gebrach ginn.
Dofir, an engem Sënn, wat méi kuerz d'Extraktiounszäit ass, dest besser ass de Kit.Firwat méchtVirdrun's Kit ënnersträichen d'Geschwindegkeet, well se et gutt kennen.
PS: Verschidde Meedercher maachen Experimenter ganz virsiichteg, awer si sinn net sou gutt wéi e Slam Dunk no e puer Joer Aarbecht.Si mengen datt Gott ongerecht ass, beschwéieren iwwer anerer, a sichen no Liewen.Tatsächlech huet si et net verstanen.Hien huet d'RNA net gutt geschützt, an de Slam Dunk-Spiller war flësseg.Wéi hien d'Experiment gemaach huet, huet hien geduecht datt hien de Slam Dunk mat dräi Mol, fënnef Mol an zwou Divisiounen fäerdeg géif maachen, awer hien huet d'Experiment gutt gemaach.
Note: Méi lues, méi Chancen vun RNase Invasioun.Wéi trainéiert Dir Iech fir séier ze sinn?Et gëtt kee Wee, just méi üben.
Fir verschidden Experimenter a verschidde Proben ass et nach ëmmer néideg fir méi Literatur ze liesen an eng passend Method fir d'Veraarbechtung ze wielen.Fir de Probe Sammlung a Späicherprozess erfuerdert MIQE datt et kloer am Pabeier geschriwwe muss ginn, sou datt d'Rezensiounen d'Zouverlässegkeet vum Pabeier iwwerpréiwen, an et ass och bequem fir déi iwwerrascht Jonker Äert Experiment ze widderhuelen.
Och wa biologesch Experimenter schwéier sinn, si si High-End.Wann Dir net virsiichteg sidd, kënnt Dir d'Welt ëmdréinen.Zum Beispill, SARS zu enger biochemescher Kris maachen, oder Hybridreis maachen fir 1,3 Milliarde Leit ze retten.D'Bild hei drënner ass e chemescht Experiment, Dir sollt verstoen wéi houfreg Dir op Är Fuerschung sidd just andeems Dir op seng Dick-ähnlech Erscheinung kuckt.Vergiess et, schwarz him net.
MIQE (3) - Nukleinsäure Extraktioun.
Nukleinsäure Extraktioun ass e grousst Evenement, an all molekulare Biologie Experimenter fänken mat Nukleinsäure Extraktioun un.Als éischt, loosst eis dem MIQE säin Inhalt iwwer Nukleinsäureextraktioun kopéieren.
Wann Dir dës Form kuckt, kënnt Dir net op der Uewerfläch bleiwen.D'Form ass en Dogma.Fir en Topstudent ze sinn, musst Dir froen firwat.De wesentleche Inhalt vun dëser Tabell ass: Verfollegtder Rengheet, Integritéit, Konsequenz, an Extraktioun Betrag vun RNA .
Den éischten Deel vun derProzess oder Instrument ass den Nukleinsäure Extraktioun Schrëtt.Wann Dir en automateschen Nukleinsäureextraktor benotzt fir ze extrahieren (fortgeschratt, kontaktéiert mech w.e.g. fir Akaf), musst Dir de Modellnumm vum Instrument uginn.
Den Numm vum Kit an
wéi eng Kit fir d'Ännerungsdetailer benotzt gouf, wéi eng speziell Reagenzë bäigefüügt goufen oder wéi eng speziell Operatioune gemaach goufen, solle kloer erkläert ginn, sou datt anerer Äert Experiment einfach widderhuelen kënnen.
E puer Leit fügen e puer spezielle Reagenzen derbäi wann se speziell Proben extrahéieren, denken datt dëst hir geheim Waff ass an anerer net soen.Wärend se geheim halen, verléieren se och d'Méiglechkeet fir Ären Artikel ze blénken.Sidd net clever, Dir musst méi éierlech sinn wéi de Land alen Zhang an der wëssenschaftlecher Fuerschung, wann Dir wëllt clever sinn, den Artikel mécht Iech domm.
muss d'Produktnummer vum Kit erënnerenwann Dir de Kit bestellt a schreift den Artikel.Et ginn allgemeng zwou Zuelen um Kit: Cat-Katalognummer (Produktnummer, Artikelnummer), Lot-Produkt Lotnummer (Gebraucht fir unzeginn aus wéi enger Batch de Produkt kënnt).
Zousätzlech gëtt d'CAS Nummer dacks benotzt wann Dir biochemesch Reagenz bestellt, an ech wäert et zesummen populariséieren.D'CAS Nummer ass d'Zuel vun der American Chemical Society fir all neit chemescht Medikament.Allgemeng sinn dräi Zuelen mat engem Bindestrich verbonnen.Rushuis CAS Zuel: 7732-18-5.Chemikalien hunn dacks multiple Aliasen, awer d'CAS Nummer ass eenzegaarteg.Wann Dir Medikamenter bestellt, kënnt Dir als éischt seng CAS Nummer kontrolléieren.
Méi no doheem, firwat musse mir dës Saache kloer beschreiwen?Tatsächlech ass et och d'Qualitéit vun der RNA Extraktioun ze kontrolléieren.D'Benotzung vun Instrumenter a Kits wäert d'RNA Extraktioun méi konsequent maachen.D'Extraktiounskala vun gewéinleche Laboratoiren ass net grouss, an et kann mat Kits kritt ginn.
D'Detailer vun der DNase oder RNase Behandlung
Déi wichteg Fro vum fluoreszent quantitativen PCR ass DNA Kontaminatioun ze vermeiden, an net experimentéieren wann et Kontaminatioun ass.Dofir ass et onbedéngt de Prozess ze soen deen Dir benotzt hutt fir d'DNA ze veraarbecht, fir ze weisen datt d'DNA am experimentellen Prozess komplett a komplett ewechgeholl gouf.duerch e schemateschen Diagramm duergestallt.
Schematesch Diagramm vun RNA an DNA
Allgemeng ass d'Method fir d'DNA ze entfernen d'RNA mat DNase no der Extraktioun ze behandelen.Allerdéngs sinn dës relativ al Methoden.Kommerziell RNA Extraktiounskits konnten DNA wärend dem Extraktiounsprozess ewechhuelen ouni DNase derbäi ze ginn.Zum Beispill eng Serie vu Kits vu Foregene.
Note: D'DNA ewechhuelen wärend der RNA Extraktioun ass e ganz geféierlecht duebelschneidegt Schwert, wat d'Operatiounszäit vun der RNA Extraktioun verlängert an de Risiko vun der RNA Degradatioun erhéicht.Prinzipiell ass et en Austausch tëscht RNA Rendement a Rengheet.
Zousätzlech ass d'Quantitéit vun DNase, déi an d'Silica-baséiert Adsorptiounskolonn bäigefüügt ass, ganz kleng, a qualitativ héichwäerteg DNase muss benotzt ginn fir den Effekt z'erreechen.Onoptimiséiert DNase kann net séier a komplett verdaut ginn.Dëst ass en Test vum techneschen Niveau vum Händler.Natierlech ginn et nach méi komesch Händler déi bretzen datt DNA ouni DNase ewechgeholl ka ginn.Et kann gesot ginn datt jiddereen, deen d'DNA bracht kann ouni DNase komplett ewechgeholl ginn, en Hooligan ass.DNA ass eng relativ stabil duebelstrengeg Struktur, an et kann net geläscht ginn nëmme vu schwätzen a laachen.
Kontaminatioun Bewäertung
Bewäertungsmethod: Elektrophorese Detektioun, 1% Agarose, 6V/cm, 15min, Luede 1-3 ul
Nukleinsäure quantitativ Analyse
gëtt normalerweis mat engem UV Spektrofotometer gemooss.Loosst mech fir d'éischt d'Bedeitung vun den dräi Wäerter vun OD260, OD280 an OD230 populariséieren.
·OD260nm: Et ass d'Absorptiounswellelängt vum héchsten Absorptiounspeak vun Nukleinsäure, an de bescht gemoossene Wäert läit vun 0,1 bis 1,0.Wann net, verdünnt oder konzentréiert d'Probe fir se an der Rei ze bréngen.
·OD280nm: Et ass d'Absorptiounswellelängt vum héchsten Absorptiounspeak vu Protein a phenolesche Substanzen.
·OD230nm: Et ass d'Absorptiounswellelängt vum héchsten Absorptiounspeak vu Kuelenhydrater.
Als nächst schwätze mer iwwer d'Roll vun all Indikator.Fir A260 kann et benotzt ginn fir d'Ausbezuele vun Nukleinsäure ze moossen.Wann OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Fir Rengheet musse mir d'Verhältnisser kucken, déi mir allgemeng gesinn: OD260/280 an OD260/230.
· Pure DNA: OD260/280 ass ongeféier gläich wéi 1,8.Wann et méi wéi 1,9 ass, weist et datt et RNA Verschmotzung ass, a wann et manner wéi 1,6 ass, weist et datt et Protein- a Phenolverschmotzung gëtt.
· Pure RNA: 1,7
·OD260/230: Egal ob et DNA oder RNA ass, de Referenzwäert ass 2,5.Wann et manner wéi 2,0 ass, weist et datt et Verschmotzung vun Zocker, Salz an organescher Matière ass.
RNA Integritéit
Et ass ganz wichteg d'Integritéit vu RNA ze moossen.Allgemeng ass et néideg en RNA Denaturatiounsgel Experiment ze maachen fir ze kontrolléieren ob d'Hellegkeet tëscht 28S an 18S RNA eng zweefach Relatioun ass.Wann déi drëtt Band 5S erschéngt, heescht et datt d'RNA ugefaang huet ze degradéieren, ausser fir Invertebraten.
Donnéeën fir RNA Qualitéit Bewäertung: Zousätzlech zu den uewe genannten Tester ginn et och e puer méi fortgeschratt Instrument Tester a punkto RNA Integritéit, sou wéi den RQI Integritéitstest vum Experion automateschen Elektrophorese System, deen erkennen kann ob RNA onsichtbar ofgebaut gëtt.
An der wëssenschaftlecher Fuerschung ass fluoreszent quantitative PCR e Verglach tëscht dem Zilgen an dem internen Referenzgen.Dofir, am Prozess vun der RNA Probe Erhaalung, RNA Extraktioun, etc., ass dat primär Zil d'Integritéit vun der RNA ze garantéieren.
Wéi d'Integritéit vun der RNA d'Gläichgewiicht tëscht dem Zilgen an dem internen Referenzgen beaflosst kann einfach aus der Figur hei ënnen verstane ginn.Degradatioun féiert zu Gen-Onvollstännegkeet, egal ob et d'Onvollstännegkeet vum internen Referenzgen oder d'Onvollstännegkeet vum Zilgen ass, et wäert e groussen Impakt op d'Donnéeën hunn.
Schematesch Diagramm vum Zilgen a Referenzgen, däerf net wouer sinn
Inhibitiounstest (ob de CT-Wäert ënner héijer oder niddereger Konzentratioun oder aner Bedéngungen ënnerdréckt gëtt)
Wann Dir dës Figur als Beispill hëlt, sinn d'Ct Wäerter vun de fënnef Kéiren wéi follegt.D'Verdeelung vun CT Wäerter tëscht de Kéiren ass ongläich, an d'Ct Wäerter sinn ënner héijen an niddrege Konzentratioune verspéit, wat de Fall vun der PCR Inhibitioun ass.
Schlësselpunkt: Am Prozess vun der RNA-Extraktioun musse mir Mëssverständnisser opginn a korrekt etabléieren.
Déi falsch Iddi ass: RNA Extraktioun verfolgt nëmmen d'Ausbezuelung, denken datt wat méi grouss d'Quantitéit u RNA kritt, dest besser.Tatsächlech, wa mir Quantifikatioun maachen, wann d'Zuel vun den Genen net ganz grouss ass, brauche mir net vill RNA.D'Quantitéit u RNA déi Dir extrahéiert ass méi wéi genuch.
Dat richtegt Konzept ass:RNA Extraktioun soll Rengheet, Integritéit a Konsistenz verfollegen.Purity kann suergen datt déi spéider ëmgedréint Transkriptioun net hemmt gëtt an d'Donnéeën net vun DNA beaflosst ginn.Integritéit garantéiert d'Gläichgewiicht vun Zilsequenzen an intern Referenzen.Konsistenz garantéiert eng stabil Probebelaaschtung.
MIQE (4) - ëmgedréint Transkriptioun
Mëssverständnis: d'Verfollegung vu méi héije Probevolumen.
Richteg Konzept: Verfollegt Konsistenz (Stabilitéit), onofhängeg vun der Quantitéit u gelueden RNA, d'Effizienz vun der ëmgedréint Transkriptioun bleift konsequent, a garantéiert datt d'Differenzen am cDNA wierklech Differenzen am mRNA reflektéieren kënnen.
Mir erklären dëse Prozess mat engem schemateschen Diagramm:
Schematesch Diagramm vun der ëmgedréint Transkriptiounseffizienz, ass net wouer
Als éischt musse mir den Ënnerscheed tëscht dem ëmgedréint Transkriptiounsprozess an dem PCR Prozess verstoen.PCR erfëllt verschidde Heizungs- a Glühprozesser, an d'Zielfragment wächst exponentiell;wärend ëmgedréint Transkriptioun dëse Prozess net huet, kënne mir eis virstellen datt ëmgedréint Transkriptioun tatsächlech een-zu-een Wärend dem Replikatiounsprozess ass, sou vill Stéck RNA
wéi et esou vill Stécker vun cDNA Informatiounen kréien kann, et soll bis elo verstane ginn, well Fragmenter grouss a kleng goufen ëmgedréint-transkribéiert, an et ass onméiglech op ee Fragment ze konzentréieren.A well d'Quantitéit u RNA relativ kleng ass, ass d'Quantitéit u kritt cDNA och relativ kleng, am Géigesaz zum PCR, deen en Amplifikatiounseffekt huet, sou datt et am Fong onméiglech ass z'entdecken.
cDNA Elektrophorese Resultater
Zweetens, am Idealfall, gëtt ëmgedréint Transkriptioun een-zu-eent gemaach, awer keng ëmgedréint Transkriptase vun enger Firma kann dësen Effekt erreechen.Prinzipiell wandert d'Effizienz vun de meescht ëmgedréint Transkriptasen tëscht 30-50%.Wann dat de Fall ass, wäerte mir éischter eng relativ stabil ëmgedréint Transkriptiounseffizienz hunn, dat ass wat mir an der Figur gesinn: 3 RNAs kréien 2 cDNAs, 6 RNAs kréien 4 cDNAs, also egal wéi vill Probe gelueden ass, ass d'Reverse Transkriptiounseffizienz relativ stabil.Mir wëllen d'Situatioun net gesinn wou ëmgedréint Transkriptiounseffizienz onbestänneg ass an héich Konzentratioun hemmt.
Also, wéi z'iwwerpréiwen ob déi ëmgedréint Transkriptiounseffizienz stabil ass?D'Method ass ganz einfach, Dir braucht nëmmen e Verglach Test ze maachen: een ass ëmgedréint an cDNA no enger Verdueblung vun der RNA verduebelt, an déi aner ass eng Verdueblung Verdënnung no ëmgedréint Transkriptioun an cDNA ze maachen, an dann qPCR maachen fir de kritt Hang ze gesinn Ass et konsequent.Als Topstudent sollt Dir et a Sekonnen verstoen.Wéi hei ënnen gewisen:
Verdünnung vu RNA an cDNA fir ze testen ob d'Effizienz vun der ëmgedréint Transkriptioun stabil ass
Reverse Transkriptase a Kit
Wéi kann perfekt fluoreszent quantitative PCR excellent ëmgedréint Transkriptase a Kit hunn.Reverse Transkriptase ass ongeféier an zwou Zorte opgedeelt no der Quell, AMV oderM-MLV, an hir Leeschtung ass déi selwecht wéi déi an der Tabell gewisen.
RNase H Aktivitéit
RNase H ass Ribonuclease H, de chinesesche Numm ass Ribonuclease H, wat eng Endoribonuclease ass, déi RNA an der DNA-RNA Hybridkette spezifesch hydrolyséiere kann.RNase H kann d'Phosphodiester-Bindungen net an eenzegstrengeg oder duebelstrengeg DNA oder RNA hydrolyséieren, dat heescht, et kann net eenstrengeg oder duebelstrengeg DNA oder RNA verdauen.Allgemeng benotzt an der Synthese vum zweete Strang vun cDNA.
Et ass eng komesch Saach.Mir soen datt ëmgedréint Transkriptase RNase H Aktivitéit huet, net datt ëmgedréint Transkriptase RNase H enthält, an et kann net méiglech sinn RNase H vun ëmgedréint Transkriptase ze trennen, vläicht wéinst der Konformatioun vu bestëmmte Gruppen an ëmgedréint Transkriptase Dës Aktivitéit gëtt vun der ëmgedréint Transkriptase verursaacht.
Dofir, onofhängeg vun der méi héijer ëmgedréiter Transkriptiounseffizienz vun AMV, reduzéiert seng RNase H Aktivitéit d'Ausbezuelung vun cDNA.Natierlech optimiséieren d'Reagenshersteller dauernd hir Produkter fir d'RNase H Aktivitéit an der ëmgedréint Transkriptase sou vill wéi méiglech ze eliminéieren fir d'Ausbezuele vu cDNA ze erhéijen.
Annealing Temperatur
Sekundär Struktur vun RNA bei verschiddenen Temperaturen
Kuckt d'Figur uewen fir déi sekundär Struktur vun RNA bei verschiddenen Temperaturen, a benotzt de mFold Online-Tool fir d'sekundär Struktur vum Zilfragment ënner spezifesche Temperatur- a Salzkonzentratiounsbedéngungen ze bestëmmen.Bei 55 ° C ass déi sekundär Struktur vun der RNA nach ëmmer ganz komplex, ëmgedréint Transkriptase kann net funktionnéieren, an déi sekundär Struktur kann net komplett geléist ginn bis 65 ° C, während déi optimal Temperatur vun AMV a M-MLV vill méi niddereg ass wéi dës Temperatur.
Wat kann een maachen?Déi sekundär Struktur ass déi komplementär Pairung vun der Schabloun selwer, wat zu enger staarker Konkurrenz tëscht dem Primer a Reverse Transkriptase an der Schabloun féiert, wat zu enger Serie vu Probleemer resultéiert wéi niddereg E a schlecht Widderhuelbarkeet.
Wat kann een maachen?Erhéicht nëmmen d'Glühungstemperatur sou vill wéi méiglech.
Vill Reagens Hiersteller verbesseren hir ëmgedréint Transkriptase duerch Gentechnik.E puer erhéijen d'Reaktiounstemperatur, wéi Jifan an Aidelai, an e puer ewechhuelen déi aktiv Grupp vum RNase H Enzym fir d'Affinitéit tëscht dem Enzym an der RNA Schabloun ze verbesseren.Héich Affinitéit kann déi sekundär Struktur kompetitiv ausdrécken a glat duerch liesen, an och d'Effizienz vun der ëmgedréiter Transkriptioun staark verbesseren.
Schlësselpunkt: ëmgedréint Transkriptioun ass méi wichteg fir d'Konsistenz vun der ëmgedréint Transkriptiounseffizienz ze verfolgen (Enzyme mussen net nëmmen effizient awer och stabil sinn), anstatt d'Quantitéit u Probe gelueden, wann et net e besonnesch grouss-Skala fluoreszent quantitativen PCR ass, wäert et guer net méiglech sinn.Multiple cDNAs.
Verschidde Hiersteller hunn och e puer Efforte gemaach an der Verfollegung no Konsistenz.Zum Beispill hunn déi meescht Firmen elo ëmgedréint Transkriptioun als Standard Kit fir ze verkafen verpackt, wat eng gutt Wiel ass.
Zum Beispill, Foregene's RT Easy Series Kits:
RT Easy I (Master Premix fir éischte Strang cDNA Synthese Kit)
MIQE (5) - Zil-Geninformatioun
Déi uewe genannte Figur erkläert
1. Ob dëst Gen effektiv ass fir widderholl Experimenter kann allgemeng duerch widderholl Experimenter verifizéiert ginn.
2. Gene ID, Dir wësst.
3. Gen Längt, d'Gesamtlängt vum Zilgen ass definitiv kee Problem.Wann Dir Primer designt, gitt sécher datt d'Längt vum Amplikon tëscht 80-200bp ass fir eng besser Amplifikatiounseffizienz ze garantéieren.
4. Sequence Blast Verglach Informatiounen, muss d'Zil-Gen zu genebank Verglach ginn Net-spezifesch amplification ze verhënneren.
5. Präsenz vu Pseudogenen.E Pseudogen ass eng DNA Sequenz ähnlech wéi en normale Gen awer verléiert seng normal Funktioun.Et existéiert dacks an der Multi-Genfamill vun Eukaryoten.Et gëtt normalerweis duerch ψ vertrueden.Et ass eng net-funktionell genomesch DNA Kopie am Genom déi ganz ähnlech ass mat der codéierender Gensequenz., sinn allgemeng net transkribéiert, an hu keng kloer physiologesch Bedeitung.
6. Positioun vun Primer relativ zu Exonen an Intronen.An de fréie Joeren, wa mir de Problem vun der DNA Kontaminatioun geléist hunn, hu mir dacks op d'Positioune vu Primer, Exonen an Intronen opmierksam gemaach, an allgemeng als Design Primer iwwer Intronen ugesinn fir DNA Amplifikatioun ze vermeiden.Kuckt w.e.g. d'Figur hei drënner: Schwaarz representéiert Intronen, verschidde Blues representéieren Exonen, Rosa representéiert allgemeng Primer, an hell rout stellt Intron-spannend Primer duer.
Schematesch, ni richteg
Wat e perfekte Plang schéngt dëst, awer tatsächlech, an de meeschte Fäll sinn d'Trans-Intron Primer net sou magesch wéi virgestallt, a si wäerten och net spezifesch Amplifikatioun verursaachen.Also de beschte Wee fir DNA Kontaminatioun ze vermeiden ass DNA komplett ze läschen.
7. Conformation Prognose.Mat dësem Beispill nach eng Kéier, benotzt de mFold Online-Tool fir déi sekundär Struktur vum Zilfragment bei enger spezifescher Temperatur a Salzkonzentratioun ze bestëmmen.
Sekundär Struktur vun RNA bei verschiddenen Temperaturen
Déi sekundär Struktur ass déi komplementär Pairung vun der Schabloun selwer, wat zu enger staarker Konkurrenz tëscht dem Primer a Schablounpaart féiert, an d'Chancen fir Primerbindung si manner, wat zu enger Serie vu Probleemer resultéiert wéi niddereg E a schlecht Widderhuelbarkeet.Duerch Softwareprediktioun, wann et kee sekundäre Strukturproblem ass, wier dat super.Wann et ass, wäert eise Suivi Artikel spezifesch diskutéieren wéi dëse Problem ze léisen.
MIQE (6) - qPCR Oligonukleotiden
Fir fluoreszent quantitativ PCR, déi éischt Saach mat där Dir all Dag kämpft ass d'RNA Extraktioun, an déi zweet Saach kann Primer Design sinn.
Als éischt iwwerpréift mir nach ëmmer d'Regele iwwer Primer Design no der MIQE Checklëscht.Et ass sou einfach, datt d'Schauspiller laache kënnen, a mir kënnen et an engem Saz fäerdeg bréngen: d'Sequenz an d'Positioun vun der Primersonde an d'Modifikatiounsmethod erausfannen.Fir d'Primer Reinigungsmethod ass d'Primer Synthese am Moment sou bëlleg, qPCR ass PAGE a méi héich Reinigungsmethoden wäertvoll, an d'Informatioun vum Syntheseinstrument ass net wichteg.Vill Leit hu fir Joerzéngte Primer gemaach a wëssen net datt de Synthesizer ABI3900 ass.
Wat d'Prinzipien vum Primer Design ugeet, musst Dir se net per Rote memoriséieren, well déi meescht Primer Design Software oder Online Tools kënnen dës Probleemer këmmeren (recommandéiert Online Tool primer3.ut.ee/), an 99,999% vum Primer Design gëtt net manuell gemaach.
Kontrolléiert just déi folgend Punkten nodeems d'Primeren entworf sinn:
1. Design Primer no beim 3'Enn: Am Fall vun der Benotzung vun Oligo dT Primer fir d'cDNA Éischt-Strang Synthese, berécksiichtegt déi ëmgedréint Transkriptiounseffizienz an d'RNA Integritéit, mussen déi entworf Primer no beim 3'Enn entworf ginn fir d'Verstäerkungseffizienz ze verbesseren.Benotzt e Bild fir wéi follegt z'erklären (et gëtt kee Wee fir dëst ze verstoen):
Firwat sollen Primer no bei der 3 'Enn entworf ginn, et däerf net stëmmen
2. TM Wäert: Den Tm Wäert ass bei 55-65 ° C (well d'Exonuklease Aktivitéit déi héchst bei 60 ° C ass), an de GC Inhalt ass bei 40% -60%.
3. BLAST: Fir net-spezifesch Amplifikatioun vum Genom ze vermeiden, muss Blast fir zousätzlech Verifizéierung benotzt ginn.
MIQE(7)—qPCR Prozess
1. qPCR Kit
Geméiss den Ufuerderunge vum MIQE musse mir déi komplett Reaktiounsbedéngungen am Artikel kloer beschreiwen, och d'Konfiguratioun vum PCR-Reaktiounssystem, wéi ee Kit benotzt gëtt, wien den Hiersteller ass, wéi grouss ass de Reaktiounssystem, ob d'Faarfmethod oder d'Sondemethod benotzt gëtt, PCR-Programmastellungen.Veteran Chauffeuren wäerten definitiv feststellen datt soulaang de Kit ausgewielt gëtt, ass déi uewe genannte Informatioun am Fong bestëmmt.
Am Moment ass d'Fabrikatioun an d'Produktioun vu fluoreszent quantitative PCR Kits eng ganz reife Technologie.Soulaang Dir net extrem schlecht Hiersteller wielt, ass d'Wahrscheinlechkeet vu Probleemer net héich, awer mir wëllen nach e puer Punkte mat Iech deelen:
Hot-Start Taq Enzym:De wichtegsten Deel vum PCR ass den Hot-Start Taq Enzym.D'Hot-Start Enzymen um Maart sinn allgemeng an zwou Zorte opgedeelt, een ass e chemesch modifizéierten Hot-Start Enzym (Dir kënnt Iech et als Paraffin Embedding virstellen), an déi aner ass e Hot-Start Enzym fir Antikörpermodifikatioun (Antigen-Antikörper bindend).Chemesch Modifikatioun ass e fréie Wee fir Enzymen ze waarm ze starten.Wann eng gewëssen Temperatur erreecht gëtt, wäert den Enzym seng Aktivitéit fräiginn.Den Antikörper-modifizéierten Hot-Start Enzym benotzt biologesch Methoden fir d'Aktivitéit vum Enzym ze blockéieren.Wann eng gewëssen Temperatur erreecht gëtt, gëtt den Antikörper denaturéiert an als Protein inaktivéiert, an d'Enzymaktivitéit gëtt an d'Spill bruecht.
Wéi och ëmmer, wat ass d'Notzung vun dësem?Dëst ass de Fall, d'Verëffentlechungsaktivitéit vun Antikörper-modifizéierten Enzymen ass méi séier wéi déi vu chemesch modifizéierten Enzymen, sou datt wat d'Sensibilitéit ugeet, Antikörper-modifizéiert Enzyme e liichte Virdeel hunn, sou datt et am Fong keng chemesch modifizéiert Enzyme an de Kits um Maart sinn.Wann et ass, ass d'Technologie vun dësem Hiersteller nach ëmmer an der Ära vum Joerdausend festgehalen.
Magnesiumion Konzentratioun:Magnesiumionkonzentratioun ass ganz wichteg an der PCR Reaktioun.Entspriechend Magnesiumionkonzentratioun kann d'Verëffentlechung vun Taq Enzym Aktivitéit förderen.Wann d'Konzentratioun ze niddreg ass, gëtt d'Enzymaktivitéit wesentlech reduzéiert;wann d'Konzentratioun ze héich ass, gëtt d'Enzym-katalyséiert net-spezifesch Amplifikatioun verstäerkt.D'Konzentratioun vu Magnesiumionen beaflosst och d'Annealung vun de Primer, d'Schmelztemperatur vun der Schabloun a PCR-Produkter, an doduerch d'Ausbezuele vun amplifizéierte Fragmenter beaflossen.D'Konzentratioun vu Magnesiumione gëtt allgemeng bei 25mM kontrolléiert.Natierlech, fir e gudde Kit, muss d'Konzentratioun vu Magnesiumionen gutt kontrolléiert ginn.E puer Händler addéieren e Magnesiumion-chelatéierend Agent zum Reagens, wat den Effekt vun der automatescher Upassung vun der Magnesiumionkonzentratioun erreechen kann.
Fluoreszent Faarf Konzentratioun:Fluorescent Dye, dat ass de SYBR Green, dee mir normalerweis benotzen, generéiert haaptsächlech Fluoreszenz andeems se un déi kleng Groove vun duebelstrenger DNA binden, well d'Bindung vum Faarfstoff un duebelstrengeg DNA net spezifesch ass, dat heescht Soulaang wéi duebelstrengeg DNA domat kombinéiert ass, kann d'Fluoreszenz optrieden, sou datt et Primer-Signal-Dimeren a Form vun engem DNA-Signal-Schabloun an de System kombinéiere wäert.
PS: Wéinst senge Liichtempfindlechen Eegeschafte sinn d'Produkter um Maart allgemeng a brong opaken Zentrifugeréier verpackt (wéi an der Foto hei ënnen).Allerdéngs wäert dëst e Problem stoussen.Et ass schwéier ze gesinn ob d'Flëssegkeet beim Prouwen gesaug gëtt.An dëser Hisiicht ass Qingke wierklech déi userfrëndlechst (wéi an der Foto hei ënnendrënner), an den transparenten Röhre ass an engem opaken Zinnbeutel verpackt.Da gitt et an eng Zinnbeutel, andeems Dir d'Bequemlechkeet berücksichtegt fir Liicht ze vermeiden an ze probéieren.Dir musst déi richteg Produktnummer wielen.TSE204 ass eng super Käschte-effikass Existenz, déi mech wëll Gras planzen.
D'Konzentratioun vum fluoreszent Faarfstoff ass och ganz wichteg.Wann d'Konzentratioun ze niddreg ass, wäert d'Verstäerkungskurve an der spéider Stuf net eropgoen an ass net perfekt;wann d'Konzentratioun ze héich ass, wäert et Kaméidi Interferenz Ursaach.Zënter datt de fluoreszent quantitativen PCR haaptsächlech vum CT-Wäert hänkt, wann d'Konzentratioun vum fluoreszent Faarfstoff net richteg ugepasst ass, ass den nidderegen Punkt besser wéi den Héichpunkt.Natierlech ass déi entspriechend Faarfkonzentratioun déi bescht.
ROX: ROX Faarfstoffer gi benotzt fir gutt-ze-gutt Fluoreszenz Signalfehler ze korrigéieren.E puer Instrumenthersteller erfuerderen Eechung, anerer net.Zum Beispill, verlaangt d'Benotzung vun Thermo Fisher Wëssenschaftlech Real Time PCR Verstäerkung Instrument normalerweis Eechung, dorënner 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc.. D'allgemeng Kit Uweisunge wäert et beschreiwen.
Foregene's qPCR Mix enthält och ROX Dye, wat bequem ass fir a verschiddene Modeller ze benotzen.
Schwaach Waasserstoffverbindungsbehandlung: D'Behandlung vu schwaache Waasserstoffbindungen ass eng relativ technesch Saach.Näischt huet d'Handbicher vu ville Kits gelies, awer keen vun hinnen huet dëst Thema erwähnt.Tatsächlech ass et sou wichteg.D'Kombinatioun vu Basen hänkt haaptsächlech vun der Stäerkt vu Waasserstoffbindungen of.Staark Waasserstoffbindunge sinn normal Verstäerkung, a schwaach Waasserstoffbindunge féieren zu net spezifescher Verstäerkung.Wann schwaach Waasserstoffverbindunge net gutt eliminéiert kënne ginn, kann net spezifesch Verstäerkung net vermeit ginn.Am Kader vum Auteur hunn nëmmen e puer Firmen dëse Problem gemierkt.Wann Dir de Kit kaaft, kënnt Dir bezeechnen ob Dir eng Léisung an dëser Hisiicht iwwerluecht hutt fir de Kit deen Dir wëllt wielen.
Reaktiounsvolumen: Den 20-50ul System gëtt méi heefeg benotzt, a méi kleng Bänn si méiglecherweis Feeler verursaachen.Allgemeng schwätzt d'Instruktioune vum Kit d'Benotzung vu PCR Reaktiounsvolumen.Sidd net intelligent a benotzt méi kleng Bänn fir Käschten ze spueren.d'Zil vun.De Volume recommandéiert vun den Händler ass tatsächlech getest ginn, an et kann sinn datt se de Problem vu Feeler, déi duerch kleng Bänn verursaacht ginn, net léisen.
2. Den Hiersteller an den Artikelnummer vun der Röhreplack
Jidderee weess de Prinzip vun der fluoreszenter quantitativer PCR.Fluoreszenzsammlung gëtt haaptsächlech duerch PCR Röhrekappen duerchgefouert.Wann Dir PCR Verbrauchsmaterial auswielt, oppassen op zwee Punkten: gutt Liichttransmission a gëeegent fir d'Instrument.Allgemeng sinn d'Brieder an d'Röhre vun Mainstream Marken gutt, awer Dir musst suergfälteg a punkto Adaptatioun wielen, soss kënnt Dir d'Instrument net benotzen.
4. Top Niveau Wëssen
MIQE (8) - qPCR Validatioun
Dëst ass d'Haaptprioritéit vum qPCR!Sou vill Helden sinn hei an de Sand gefall.Natierlech ass et och méiglech datt Dir Gléck hutt an d'Gen déi Dir studéiert hutt einfach sinn, sou datt Dir duerch d'Äishöhl laanscht de Wand geschwemmt hutt.D'Verifizéierungsinformatioun vu qPCR soll d'Zouverlässegkeet vun den Donnéeën testen.Mir lëschten déi néideg Verifikatiounsinformatioun wéi follegt:
1.Spezifizitéit Test
D'Spezifizitéit vun der Zilgen-Amplifikatioun gëtt getest andeems Dir kontrolléiert ob d'Elektrophoresebild eng eenzeg Band ass;Sequenzéierungsverifizéierung;Schmelzkurve fir ze kucken ob d'Spëtzekaart eenzeg ass;Enzym Verdauungsverifizéierung an aner Methoden.
Hei konzentréiere mir eis op thien Analyse vun Net-spezifesch amplification mat der Method vun Schmelzkurven benotzt.Am Allgemengen, wa mir Primer designen, ass d'Gréisst vum Produktfragment erfuerderlech am Beräich vun 80-200bp ze sinn, wat d'Schmelztemperatur vum PCR-Produkt 80-85 °C Beräich mécht.Dofir, wann et verschidde Peaks sinn, mussen et aner net spezifesch Verstäerkungsprodukter sinn;wann de Peak ënner 80 ° C erschéngt, gëtt et allgemeng als Primer Dimer ugesinn;wann den Héichpunkt iwwer 85 ° C erschéngt, gëtt et allgemeng als DNA Kontaminatioun oder méi Nonspecific Amplifikatioun vu grousse Fragmenter ugesinn.
Bemierkung: Heiansdo gëtt et nëmmen een eenzegen Héichpunkt bei 80°C.Zu dëser Zäit muss dëst Konzept agehale ginn.Et ass méiglech datt d'Verstäerkungsresultater all Primerdimer sinn.
Normal Schmelzkurve (een eenzege Peak ouni net spezifesch Verstäerkung)
Problematesch Schmelzkurve (net spezifesch Verstäerkung vu spurious Peaks)
【Fall Analyse】
Et gëtt en Haaptpeak, awer de Primer Dimer ass eescht
D'Single-Peak Schmelzkurve an der Figur hei drënner kann Är Aen einfach täuschen, denken datt et e perfekt Experiment ass, awer d'Resultat ass komplett falsch.Zu dëser Zäit musse mir d'Schmelztemperatur kucken.D'Spëtzttemperatur ass ënner 80 ° C, wat komplett Primer-Dimer ass.
Keen Zilfragment, all Primerdimer
Hei kann mäi Brudder net ophalen.D'Foto hei drënner ass eng Foto, déi mat engem Handy geholl gouf, deen mir vun engem Schmutz geschéckt huet.D'Reagenser déi hie benotzt huet sinn all allgemeng benotzt Marken an der Industrie.Hien geännert vun engem T-Präfix Mark zu engem aneren T-Präfix Mark.Ech mengen, du hues et scho geroden.De Scumbag huet mir geruff: "De Reagens, deen op der éischter Foto benotzt gëtt, ass ze gutt, an den Héichpunkt ass eenzeg.Méi spéit, nodeems Dir de Reagens benotzt deen Dir recommandéiert hutt, gëtt et wéi dat zweet Bild, mat gemëschte Peaks.Du hues mech miserabel gemaach."
Trennt déi zwee Grafiken.Op den éischte Bléck huet een een eenzegen Héichpunkt, an deen aneren huet en duebele Peak.Nonsense, een eenzegen Héichpunkt ass natierlech gutt.Ass dat wouer?
Méi schlëmm wéi den Dou E, wann ech déi zwou Fotoen hei drënner setzen, da versteet Dir direkt.Tatsächlech si mir ganz einfach vun dëser Aart vu Bild gelämt.No virsiichteg Analyse hu mir festgestallt datt: den Héichpunkt vun der éischter Figur bei 75 ° C ass, wat komplett Primer Dimer ass;den Héichpunkt vun der zweeter Figur erschéngt bei 75 ° C an 82 ° C, op d'mannst do sinn D'Produkt erschéngt.
Biller vu Feedback vu Studenten
Also de fundamentale Problem ass net de Problem vu Reagenzen, mee de Problem vum Primer Design.Zur selwechter Zäit beweist et och datt e puer grouss Marken net vun Eisenqualitéit sinn, an et beweist och wat mäi Brudder virdru gesot huet: Et ass net d'Reagensmark déi Ären Artikel ënnerstëtzt.Et ass Ären Artikel deen d'Mark vun de Reagenzen opgestallt huet.Stellt Iech einfach vir, wann de Scumbag d'Reagens net verännert, déi falsch Donnéeën an de Journal geschéckt ginn, a wat geschitt wier eng Tragedie.
2. Ct Wäert vun eidel Kontroll
Erklärt net, wann déi eidel Kontroll e Ct Wäert huet, ass et net eng Verschmotzung?Wéi och ëmmer, Dir musst nach ëmmer verstoen wéi eng eidel Kontroll e Ct Wäert huet.Wann et NTC ass, heescht et datt et auslännesch DNA gëtt wéi Reagenskontaminatioun.Wann et NRT ass, heescht et datt déi extrahéiert RNA DNA Kontaminatioun huet.
3. Standardkurve
Den Hang an d'Berechnungsformel abegraff, kann d'PCR Effizienz duerch d'Formel berechent ginn.E perfekte Experiment erfuerdert den Hang vun der Standardkurve fir 3,32 ze kommen, an R² fir 0,9999 ze kommen.
4. Linearschrëft dynamesch Beräich
Den dynamesche Beräich vun der Reaktioun ass linear.Laut der Schabloun, déi benotzt gëtt fir d'Standardkurve ze generéieren, sollt d'dynamesch Gamme op d'mannst 5 Konzentratiounsgradienten enthalen, an oppassen op d'Ännerung vun Ct Wäerter bei héije Konzentratiounsgradienten an niddrege Konzentratiounsgradienten.
5. Detectioun Richtegkeet
Ännerungen an qPCR Resultater, dat ass, schlecht repeatability, dat ass, aarmséileg Präzisioun, sinn duerch vill Faktoren verursaacht, dorënner Temperatur, Konzentratioun an Operatioun.qPCR Präzisioun gëtt allgemeng manner kontrolléierbar wéi d'Kopiezuel erofgeet.Idealerweis bannent experimentell Variatioun, soll dës technesch Variatioun vun der biologescher Variatioun ënnerscheeden, a biologesch Replikate kënnen direkt statistesch Differenzen an qPCR Resultater tëscht Gruppen oder Behandlungen adresséieren.Besonnesch fir diagnostesch Assays muss déi bescht Inter-Assay Präzisioun (Wiederholbarkeet) iwwer Siten a Betreiber gemellt ginn.
6. Detektiounseffizienz an LOD (am multiplex qPCR)
LOD ass déi niddregst Konzentratioun vun 95% vu positive Proben entdeckt.An anere Wierder, d'Konzentratioun vu LOD, déi an engem Set vun Zilgen-Replikater enthale sinn, sollt net méi wéi 5% vun de gescheiterte Reaktiounen sinn.Wann Dir multiplex qPCR Analyse maacht, besonnesch fir gläichzäiteg Detektioun vu Punktmutatiounen oder Polymorphismen, muss multiplex qPCR Beweiser ubidden datt d'Genauegkeet vu multiple Zilfragmenter net am selwechte Rouer kompromittéiert ass, Multiple Detectioun an Single Tube Detektioun Effizienz an LOD sollten d'selwecht sinn.Besonnesch wann héich-Konzentratioun Zil Genen an niddereg-Konzentratioun Zil Genen gläichzäiteg amplifizéiert sinn, muss dëse Problem opmierksam gemaach ginn.
Problemer a LéisungenAllgemeng schwätzt d'Problemer déi dacks am qPCR Debugging begéint sinn op déi folgend Aspekter:
· net spezifesch Verstäerkung
· Schwiereg Wiel vun der Primerkonzentratioun a Probleemer mat Primer-Dimeren
· D'annealing Temperatur ass ongenau
· Sekundär Struktur beaflosst d'Verstäerkungseffizienz
net spezifesch Amplifikatioun
net spezifesch Amplifikatioungeschitt , et gëtt allgemeng berücksichtegt ob de Primer Design net gëeegent ass, awer wann Dir net presséiert d'Primeren z'änneren, kënnt Dir als éischt déi folgend Methoden probéieren (de Prinzip ass och befestegt):
· Erhéijung vun der annealing Temperatur - probéieren schwaach Wasserstoff Obligatiounen ze maachen net erhalen;
·Shorten annealing an elongation Zäit - reduzéieren d'Chance vun schwaach Waasserstoff Obligatiounen;
· Reduzéiert Primer Konzentratioun - reduzéieren d'Chance fir Bindung vu redundante Primer an Net-Zilregiounen;
Niddereg Verstäerkungseffizienz
Déi Géigendeel Situatioun zu net spezifesch Verstäerkung - niddereg Verstäerkungseffizienz, an d'Moossname fir mat gerénger Verstäerkungseffizienz ze këmmeren si just de Géigendeel:
· Verlängert d'Glühung an d'Verlängerungszäit;
· Ännerung op Dräi-Schrëtt PCR a reduzéieren d'annealing Temperatur;
· Erhéijung der Primer Konzentratioun;
Ps: Vill Graduéierter gebuer an den 90er Joren sinn net gewëllt ze studéieren wéi een Experimenter debuggen, an hoffen datt de Kit de Problem komplett léise kann (wann Dir wëllt an eng Reagensfirma goen fir Fuerschung an Entwécklung nom Ofschloss ze maachen), Tatsächlech denken d'Reagenshersteller och esou, ech hoffen et ass en Narr Et kann benotzt ginn wann Dir et kritt, also reagens Hiersteller hunn d'Spezifizitéit vun der Introduktioun léisen, inklusiv de Problem vun net-Induktioun. Absorptiounsfaktoren.Fir de Problem einfach ze léisen, mussen Narren nach ëmmer d'Aféierung vun der Reagensfirma liesen fir ze kucken ob et e Faktor ass deen schwaach Waasserstoffbindungen absorbéiert.
Schwiereg Wiel vun der Primer Konzentratioun a Probleemer mat Primer-Dimer
Method 1: Am allgemengen hunn d'Kitinstruktioune fir qPCR recommandéiert Systemer a recommandéiert Primerkonzentratioune.
Method 2: Debugging andeems Dir de Primer Konzentratiounsgradient setzt.D'Bild hei drënner ass vun enger Firma geklaut fir ze illustréieren.D'Figur hei ënnen weist d'Fluoreszenz quantitativ Resultater gemaach mat dräi Primer Konzentratiounsgradienten (100nM, 250nM, 500nM) a véier Schabloun Konzentratiounsgradienten (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).De Ct Wäert vun den experimentellen Resultater ass wéi follegt geplot:
Primer Konzentratioun Selektioun Concatenéiert all Primer Konzentratioun an eng Linn wéi follegt:
D'Wiel vun der Primer Konzentratioun ass offensichtlech, d'linear Relatioun vun der Primer Konzentratioun vun 100nM an 250nM ass besser, an d'linear Relatioun vun der Primer Konzentratioun vu 500nM ass relativ schlecht.An 100nM an 250nM ass de Ct Wäert vun 250nM relativ kleng, sou datt déi optimal Primer Konzentratioun 250nM ass.Allgemeng schwéier Primer-Dimer kënnen an der Schmelzkurve gesi ginn.Wat wann déi entworf Primer net Primer-Dimer vermeiden kënnen?
Method 3: Reduzéieren d'Quantitéit vun de Primer an d'Erhéijung vun der annealing Temperatur (net néideg ze erklären).
Den empiresche Wäert vun der Glühungstemperatur ass 60 ° C.Wann Dir net sécher sidd, wéi kënnt Dir eng méi gëeegent Glühtemperatur auswielen?D'Äntwert ass d'selwecht wéi d'Wiel vun der Primer Konzentratioun -Gradient Test.Huelt eng Foto vun der Firma Bio-rad fir de Problem ze illustréieren.Fir d'Verstäerkung vun engem bestëmmten Zilfragment, setzt aacht Temperaturgradienten, jidderee mat dräi Wiederholungen, an déi kritt Verstärkungskurve ass wéi follegt:
annealing Temperatur Auswiel:
· 70 ° C, 69 ° C - Prinzipiell kënnen d'Primeren net kombinéiert ginn, sou datt et keng Amplifikatioun gëtt.
· 67,3 ° C - Et gëtt eng kleng Quantitéit vun amplification am Ufank, an de Ct Wäert ass relativ grouss.
·64,5°C——De Ct Wäert geet erof.
· Bei 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C a 55,0°C hunn d'Ct-Wäerter am Fong tendéiert stabil ze sinn, awer déi lescht Fluoreszenzwäerter waren anescht.
Wéi wielen ech?Prinzip: Den éischte Prinzip ass de méi héije Ct Wäert.Fir deeselwechte Ct-Wäert, wielt eng méi héich Glühtemperatur fir Dimeriséierung an net spezifesch Verstäerkung ze vermeiden.Och wann et e méi héije Fluoreszenzwäert bei 55 ° C ass, kann et Dimeren oder net spezifesch Amplifikatioun dra sinn.
Awer wann Dir esou schlau sidd wéi Dir, wäert Dir definitiv denken: Logesch gesinn, wann d'PCR-Reaktioun ganz spezifesch ass, soulaang d'Primerkonzentratioun de Mindestbedarf iwwerschreift, sollten déi héich an déif Punkten keen Effekt hunn, grad wéi fluoreszent Faarfstoffer an dNTPs.Tatsächlech, soulaang d'Annealtemperatur richteg optiméiert ass, gëtt den Effekt vun der Primer Konzentratioun op Ct Wäert natierlech miniméiert.
D'annealing Temperatur ass richteg optimiséiert, an den Effet vun primer Konzentratioun op CT wäert miniméiert ginn
Sekundär Struktur beaflosst d'Verstäerkungseffizienz
Loosst eis d'Bild vum Bio-rad huelen fir de Problem ze illustréieren.Et designt och en Temperaturgradient fir e Gen mat enger sekundärer Struktur ze verstäerken.
Sekundär Struktur entsteet
Et kann gesi ginn datt wann d'Temperaturgradient erofgeet, Produkter fänken un ze erschéngen an de Ct-Wäert no vir beweegt, de Minimumwäert op 60,7 ° C erreecht, an dann, wéi den Temperaturgradient erofgeet, gëtt de Ct-Wäert méi grouss.Ëmgekéiert, wéi d'Temperatur eropgeet, mécht d'sekundär Struktur op an d'Verstäerkungseffizienz erhéicht.Nodeems Dir eng gewëssen Temperatur erreecht hutt, kann d'Erhéijung vun der Temperatur d'Verstäerkungseffizienz net verbesseren.Well d'Primer kënnen zu dëser Zäit net stabil kombinéiert ginn.Dofir,kuckt no der Temperatur mat dem niddregsten Ct Wäert, wat déi bescht Temperatur fir d'Verstäerkung vun der sekundärer Struktur Schabloun ass!Natierlech musse Smart Narren wëssen datt wann et net néideg ass, ass et am beschten d'Primeren z'änneren an d'sekundär Strukturregioun ze vermeiden.
5. Applikatioun Niveau
MIQE—Datenanalyse
D'Datenanalyse gëtt haaptsächlech vum fluoreszent quantitativen PCR-Instrument gegeben.Am viregten Artikel gouf vill Datenanalyseaarbecht gemaach, sou wéi d'Blank Kontroll, déi am Design vum Experiment erkläert gouf.Déi intern Referenzgenen, widderhuelen Zuelen, etc., Hei erkläre mir haaptsächlech d'Applikatioun vu qPCR.
qPCR gëtt wäit benotzt, an experimentell Verifizéierung an Nukleinsäurediagnos sinn déi meescht benotzt Szenarie.
absolute Quantifizéierung
Log (initial Konzentratioun) huet eng linear Relatioun mat der Zuel vun Zyklen.Eng Standardkurve kann aus engem Standard mat enger bekannter initialer Kopienummer gezunn ginn, dat heescht, d'linear Relatioun vun der Amplifikatiounsreaktioun ka kritt ginn.Geméiss dem Ct Wäert vun der Probe kann d'Konzentratioun an der Probe berechent ginn.De Betrag vun Templates fir ze enthalen.
Absolut quantitativ Berechnungsmethod
Absolut Quantifizéierung muss op der Standardkurve baséieren.Fir eng Standardkurve ze maachen, ass e Standard erfuerderlech.Normalerweis ass de Standard e Plasmid kritt duerch Klonen vum Zilgen.Firwat ass et e Plasmid?Well kreesfërmeg Plasmid DNA ass déi stabilst.Verdünnt de Standardprodukt a 5 bis 6 Gradienten no dem Verdueblungsverhältnis (10-fache Verdünnung), a passt op d'Uniformitéit beim Verdünnung op.Loosst de Ct Wäert tëscht 15-30 falen.
Standard Virbereedung
Zur selwechter Zäit soll d'Probe fir ze testen och deementspriechend verdünnt ginn (erënnert un de Verdünnungsfaktor), an de Ct-Wäert soll och tëscht 15-30 falen.De Standardprodukt + d'Probe fir ze testen ginn zesummen op der Maschinn gesat.Nom Laf gouf eng Standardkurve mat der Standardsubstanz gemaach, an d'Proben fir ze testen goufen an d'Standardkurve bruecht fir d'Konzentratioun ze berechnen.
Hepatitis B Virus HBV Quantifikatioun ass eng typesch absolut Quantifikatioun, déi d'Viruskopienummer an 1ml Blutt berechent.
Berechnung vun Kopie Zuel
Probe Konzentratioun fir ze testen (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × Verdünnungsfaktor
Probemolekulargewicht = Zuel vun de Basen × 324
D'Kopienummer vun der Probe déi getest gëtt (Kopie/ul) = d'Konzentratioun vun der Probe déi getest gëtt / Molekulargewiicht vun der Probe × 6 × 1014
Berechnung Method vun Kopie Zuel
Dat hei uewen ass d'Berechnungsmethod fir d'Quantitéit ze bestëmmen.Dëst ass e mathematesche Problem deen nom Ofschloss vum Junior Highschool geléist ka ginn, a mathematesch Probleemer ginn allgemeng vu Computere geléist.Wann Dir net versteet, kënnt Dir kommen fir ze kommunizéieren.
relativ Quantifizéierung
Relativ Quantifikatioun gëtt haaptsächlech an der wëssenschaftlecher Fuerschung benotzt.Wéi vill Viren sinn et an 1ml Blutt, an et ass en DNA Virus, dëst ass e relativ deterministescht Event: d'Quantitéit u Blutt kann bestëmmt ginn, an den DNA Virus ass relativ stabil.Wéi och ëmmer, et ass schwéier fir eis d'Zuel vun den Transkriptiounskopien vun engem bestëmmte Gen an engem Blat ze vergläichen, well et schwéier ass d'Gréisst, d'Gewiicht an d'Zärtheet vum Blat ze bestëmmen, d'Quantitéit vun extrahéierten RNA ass schwéier ze bestëmmen, an d'Effizienz vun der ëmgedréint Transkriptioun ass och schwéier ze bestëmmen, dat heescht, all Schrëtt kann d'experimentell Donnéeën hunn Bugs a kënnen net benotzt ginn.
Dofir muss d'relativ Quantifikatioun en Element aféieren:den internen Referenzgen.
An anere Wierder, relativ Quantifikatioun ass tatsächlech e Verglach tëscht dem Zilgen an dem internen Referenzgen.Am Verglach am selwechte Tissu an der selwechter Zell ass den Afloss vun der Probegréisst, RNA Extraktiounsbetrag, ëmgedréint Transkriptiounseffizienz, an PCR Effizienz relativ kleng.Wéinst der klenger Prouf Gréisst, souwuel intern Referenz Genen an Zil Genen sech relativ reduzéiert.Dofir hu mir d'Uniformitéit an d'Stabilitéit scho betount.
Intern Referenz Genen sinn allgemenghousekeeping Genen(Haushaltungsgenen), déi op eng Klass vun Genen bezéien, déi stabil an all Zellen ausgedréckt sinn, an hir Produkter sinn néideg fir d'Basis Liewensaktivitéite vun Zellen z'erhalen.
Maacht dëst Konzept net duercherneen.Housekeeping Genen si biologesch Funktiounsbegrëffer, während intern Referenzgenen experimentell technesch Begrëffer sinn.Housekeeping Genen musse Validatioun passéieren ier se als intern Referenzgen ausgewielt kënne ginn.
Zum Beispill, ausgewielt mir e puer housekeeping Genen an der Figur ënnendrënner hir Ausdrock Niveauen an verschidden Otemschwieregkeeten Zellen ze Test, a fonnt, datt den Ausdrock Niveau vun β-2-microglobulin ganz anescht wéi déi vun deenen aneren dräi Genen waren, sou datt se net als intern Referenz Genen benotzt ginn.
Nodeems Dir d'Korrekturfunktioun vum internen Referenzgen versteet, ginn zwee Algorithmen ofgeleet wéinst der Aféierung vum internen Referenzgen.
· duebel Standard Curve Method
·2 – △△Ct Method (CT Wäertvergleichsmethod)
Wann Dir interesséiert sidd Arten a Genfunktiounen ze studéieren, gitt weg d'Fuerschung iwwer Algorithmen a benotzt Formulen direkt, oder benotzt Maschinnen direkt;wann Dir en direkten Typ an der Mathematik an der Ingenieur sidd, fillt Iech w.e.g. gratis.
duebel Standard Curve Method
Quantifizéiert d'Zil-Gen an d'Haushaltsgen vun der Kontrollprobe an d'Probe fir duerch d'Standardkurve ze testen, an berechent dann de relativen Wäert no der Berechnungsformel, wat de relativen Ausdrockniveau ass.
Virdeeler: einfach Analyse, relativ einfach experimentell Optimisatioun
Nodeel: Fir all Gen muss all Ronn vun Experimenter eng Standardkurve maachen
Applikatioun: Ee vun den zwee am meeschte benotzten an unerkannten relativen quantitative Methoden an der Studie vun der Genausdrockregulatioun
D'Formel ass wéi follegt:
Beispiller sinn wéi follegt:
Berechent de relativen Betrag baséiert op dem quantitative Resultat
2 - △△Ct Method (CT Wäert Verglach Method)
Virdeeler: Kee Grond fir eng Standardkurve ze maachen
Nodeeler: Et gëtt ugeholl datt d'Verstäerkungseffizienz no bei 100% ass;d'Standardabweichung ass <5%, an d'Standardkurve an d'Effizienz tëscht all Amplifikatioun ginn ugeholl datt se konsequent sinn;d'Optimiséierung vun experimentellen Bedéngungen ass méi komplizéiert.
Applikatioun: Ee vun den zwee am meeschte benotzten an unerkannten relativen quantitative Methoden an der Studie vun der Genausdrockregulatioun
Natierlech ass d'Verstäerkungseffizienz normalerweis onméiglech fir perfekt ze sinn 1. Korrektiounsmethod: Wa mir wëssen datt d'Zilgen an d'Referenzgen déiselwecht Amplifikatiounseffizienz hunn, awer d'Verstäerkungseffizienz ass net gläich wéi 1, da kann 2-△△Ct korrigéiert ginn als: (1+E )－△△Ct, wann d'Formel 0 Amplifikatioun, zum Beispill 1, d'Korrektheetseffizienz ass, 1 .95–△△Ct
Bis elo ass den Inhalt iwwer fluoreszent quantitative PCR op en Enn komm.
Post Zäit: Apr-06-2023
